Биотехнологии, базирани на изолирани протопласти
Хибридизацията на растителни соматични клетки чрез сливане на изолирани протопласти е друг начин за създаване на генетично разнообразие за размножаване. Предимството на този метод е възможността за прехвърляне на желаните гени на дълги таксономични разстояния. Това е особено важно, когато сексуалното кръстосване не е възможно и методите in vitro, които помагат за преодоляване на прогамна или постгамна несъвместимост, не помагат.
Получаването на соматични хибриди стана възможно след разработването на техники за сливане на изолирани протопласти и тяхното култивиране върху хранителни среди, допълнени с осмотични стабилизатори.
По време на култивирането изолираните протопласти и техните продукти на сливане образуват нова клетъчна стена, извършват серия от последователни деления и се превръщат в колонии от калусни клетки. Прехвърлянето в среда за регенериране предизвиква образуването на примордии на стъблото или ембриоиди и завършва с регенерация на растението. Етапът на получаване на изолирани протопласти, поради наличието на голям набор от ензимни препарати с пектолитично и целулозно действие, както и препарати, които активно разрушават хемицелулозата, не е особено труден.
При изолиране на протопласти се използват следните разтвори на ензимни препарати:
1). От мезофила на тютюневия лист: целулаза - 2,5%, пектиназа - 0,25%, манитол - 0,4 М.
2). От мезофила на листата и суспензионните култури от картофи: ксиланаза -2%, манитол - 0,3-0,4%.
3). От калусни тъкани на пшеница: целулаза 1-2%, пектиназа - 0,3%, CaCl2 - 0,25 М (осмотичен).
4). От хипокотили на рапица: целулаза - 0,5%, мацерозим - 0,05%, манитол - 0,4 М.
За да се подготвят листата на растения от епруветка за инкубиране в ензимен разтвор, долният епидермис се отстранява или отрязватехните пас ленти с ширина 0,5-1 mm (за предпочитане в плазмолитичен разтвор). След това листата се поставят върху повърхността на ензимния разтвор и се плазмолитично и инкубират в ензимния разтвор (времето, температурата и pH на буфера или средата се избират емпирично).
Когато меристемни тъкани се използват за изолиране на протопласти, спонтанно сливане на протопласти се случва в малък брой.
За индуцирано сливане на изолирани протопласти с цел хибридизация на соматични клетки се използват следните методи:
1). Добавяне на вещества, стимулиращи сливането, към инкубационната среда на изолирани протопласти. Добавят се например нитрати (NaNO3), полиетилен гликол (PEG), среда с високо pH и висока концентрация на калциеви йони.
2). Метод Као (1976).
- С пипета на Пастьор, суспензия от протопласти (0,1 ml) се прехвърля върху покривно стъкло, поставено в петриево блюдо (60 x 15 mm).
- След 5 минути (след като протопластите се утаят на дъното на капката) внимателно добавете на малки капки 0,45 ml 40% разтвор на полиетилен гликол.
- Инкубирайте при стайна температура за 15-30 минути.
- Внимателно добавете в рамките на 10 минути 0,5 ml от хранителната среда, в която ще се култивират протопластите.
- Измийте протопластите 5 пъти, като добавите прясна хранителна среда с интервал от 5 минути между добавянията. Преди добавяне на нова порция върху покривното стъкло се оставя тънък слой от старата среда, за да не се изсушат] протопластите.
3). Сливане с електрически ток.
Методът за електрофузия на изолирани протопласти се основава на използването на нехомогенно електрическо поле, генерирано от променлив ток с напрежение 100 V и честота 50 Hz в камера, където се поставят изолирани протопласти и платинаелектроди. При тези условия се наблюдава диелектрофореза и протопластите се подреждат във верига между електродите. За термоядрения синтез се използва силен DC импулс от 1,2 kV/cm за 50 μs.
Техниката за получаване на изолирани протопласти е разработена за много растения. Култивирането и производството на тяхна основа е по-лесно за представителите на нощницата, зеле, чадър, рута и някои други семейства, по-трудно за зърнени и бобови култури. И тук вече има успехи: беше възможно да се получат колонии от оризови протопласти, изолирани от тъкан на калус, възникнали от микроспори. При четири от тях се наблюдава развитие на корени и стъблени примордии, от които един образува разсад.
Ембриони и разсад са получени в клетъчна суспензия, произхождаща от протопласти на африканско просо. Изследователи от Mitsubishi в Япония успяха да получат растение - соматичен хибрид чрез сливане на протопластите на ориза и просото.
Анализът на перспективите за далечна соматична хибридизация, която води до производството на растения с хибриден ядрен геном за практическо размножаване, далеч не е толкова оптимистичен. Възможно е да се получат само междувидови, а не отдалечени хибриди.
При междувидова соматична хибридизация могат да възникнат както стерилни, така и фертилни растения. В последния случай е възможно да се получи потомство от самоопрашване или обратно кръстосване с сортове. Последното е важно, тъй като често хибридите (например между сортове картофи и диви видове) са доминирани от признаци от диви видове.
Основната разлика между соматичните хибриди, получени чрез сливане на протопласти, и хибридите, получени по полов път, е, че в повечето случаи по време на половото кръстосване цитоплазмените гени се предават само на майката.от, със соматична хибридизация - от двамата родители.
Разделянето на ядрата на соматичните хибриди, сливането на изолиран протопласт с цитопласт без ядро, сливането на реципиентния протопласт с енуклеиран протопласт или протопласт, чието ядро е инактивирано от облъчване и не може да се дели, води до производството на така наречените кибриди. Цибридизацията е метод за въвеждане на важни цитоплазмени гени, носещи такива характеристики като CMS, резистентност към определени хербициди и патогени, в изолиран протопласт на растение с генотип, представляващ интерес за селекционера.
В литературата има информация за прехвърляне по този метод на гена за резистентност към триазинови хербициди, кодиращ синтеза на хлоропластен мембранен протеин с молекулно тегло 32 000 D от устойчиво растение черна картофена нощенка. Може да представлява интерес да се използва хибридизация за прехвърляне на гена за резистентност към тентотоксин (Alternaria solanii) от тютюн към картофи, както и други гени, определящи цитоплазмената резистентност. При прехвърляне на цитоплазмени гени, в допълнение към метода на сливане на изолиран реципиентен протопласт с цитопласт или протопласт с инактивирано ядро, могат да се използват други методи за въвеждането им: микроинжекция и трансфер с помощта на липозоми.
Методите и условията за манипулиране на клетките, които могат да се нарекат собствено инженерство на растителни клетки, все още се разработват от биотехнолозите, техните последствия в повечето случаи не са проучени.