Диагностично значение на туморния маркер TU M2-PK при бъбречни неоплазми - автореферат
Автореферат на дисертация по медицина на тема Диагностично значение на туморния маркер TU M2-PK при бъбречни неоплазми
Като ръкопис UDC 616.858-616.62-008.22
МОВСЕСЯН Ваге Ваняевич
ДИАГНОСТИЧНО ЗНАЧЕНИЕ НА ТУМОРНИЯ МАРКЕР ЗА M2-RK ПРИ БЪБРЕЧНИ ТУМОРИ
АВТОРЕФЕРАТ на дисертация за научна степен кандидат на медицинските науки
Работата е извършена в Българската медицинска академия за следдипломно обучение, Росздрав.
Доктор на медицинските науки
Александър Василиевич Серегин
Доктор на медицинските науки, професор
Андрей Владимирович Зайцев
доктор на медицинските науки,
Асламазов Едуард Гургенович
Водеща институция: Български държавен медицински университет на Росздрав
Дисертацията може да се намери в библиотеката на MGMSU (Москва, ул. Вучетич, 10а)
Научен секретар на Дисертационния съвет
доктор на медицинските науки, професор
ОБЩО ОПИСАНИЕ НА РАБОТАТА
В България, както и в повечето развити страни по света, се наблюдава тенденция към устойчиво нарастване на заболеваемостта от злокачествени новообразувания и смъртността от тях. Освен това през последните години се наблюдава стабилно нарастване на заболеваемостта от рак на бъбреците с ръст от 4,5% годишно. Сред туморите на пикочно-половата система ракът на бъбреците е на трето място, а по смъртност е на първо място. Една от основните причини за такава висока смъртност според нас е високото разпространение на туморния процес при около една трета от първоначално диагностицираните пациенти. Тъй като клиничната картина на ракБъбрекът е променлив и многостранен и като правило няма изразени симптоми, тогава до 86% от туморите се откриват случайно. В тази връзка става очевидна необходимостта от разработване на скринингови програми, насочени към активно откриване на рак на бъбреците и уместността на търсенето на общодостъпен и минимално инвазивен диагностичен метод. Освен това е добре известно, че успешното лечение на пациенти с рак на бъбреците (както и на други пациенти с рак) изисква постоянно динамично проследяване на ефективността му с цел навременно откриване на прогресията на заболяването. Един от възможните начини за решаване на тези проблеми е използването на серологични тумор-асоциирани маркери, тъй като днес те вече са заели своето достойно място в диагностиката и наблюдението на други видове рак (на простатата, на яйчниците, на гърдата, на дебелото черво и др.).
През последните години бяха направени опити да се използват такива добре познати ОМ като SCC, CA-125, CEA, CA-50, CA-19-9, CA-15-3, TATI при пациенти с рак на бъбреците, за да се изясни лабораторната диагностика, да се оцени ефективността на текущата терапия и предклинично откриване на рецидиви. Те обаче не са намерили широко приложение поради ниската си чувствителност и специфичност.
Цел и задачи на изследването
Целта на настоящото изследване е да се определи диагностичната значимост на туморния маркер Ti M2-RK при бъбречни неоплазми.
В съответствие с целта на изследването бяха формулирани следните цели на изследването:
Определете диагностичното значение на туморния маркер
1. с доброкачествени тумори и кисти на бъбреците.
2. в началните стадии на рак на бъбреците.
3. с локално напреднал и метастатичен рак на бъбреците.
4. за откриване на рецидив ипрогресия на заболяването.
Научна новост на изследването
В резултат на изследването за първи път е установена диагностичната значимост на представител на нов клас ОМ-„метаболитни маркери" - Ti M2-RK при рак на бъбрека. Значителни разлики в нивата на този маркер при пациенти с рак на бъбрека и
пациенти с доброкачествени тумори и кисти. Въз основа на анализа на нивата на изследвания ОМ при пациенти с рак на бъбреците в ремисия, в хода на проследяването и с клинично доказана прогресия на тумора, беше показана целесъобразността от използване на Ti M2-RK за оценка на ефективността на лечението и предклинично откриване на туморни рецидиви и метастази.
Практическо значение на изследването
Резултатите от изследването ще направят възможно използването на туморния маркер Ti M2-RK в скринингови програми за изясняване на диагнозата при съмнение за злокачествено заболяване, за откриване на рак на бъбреците в по-ранни стадии, при динамично наблюдение след хирургично лечение с цел предклинично откриване на прогресията на туморния процес и развитието на рецидив, което в крайна сметка ще подобри резултатите от лечението и значително ще намали смъртността от това заболяване.
Внедряване в практиката
Разпоредбите на представената за защита дисертация:
1. Препоръчително е в скрининговите програми за активно откриване на рак на бъбреците да се включи изследването на нивото на туморния маркер Ti M2-RK
2. За да се подобри качеството на диагностиката на рак на бъбреците, да се определи нивото на туморния маркер Ti M2-RK в комбинация с други диагностични методи.
3. Определяне на нивото на Ti M2-RK при диференциална диагноза на доброкачествени и злокачествени тумори на бъбреците.
4. Нивото на Ti M2 -RK трябва да се изследва след операция,след 3 месеца, за да се оцени ефективността на неговото прилагане, тактиката на по-нататъшното лечение, необходимостта и целесъобразността от предписване на адювантна терапия. Също така при динамично наблюдение на пациенти с рак на бъбреците с цел предклинично откриване на прогресията на заболяването. Апробационна дисертация
Резултатите от дисертационното изследване са отразени в докладите:
3. Конференции: "Онкоурологията: основни аспекти" в рамките на Български медицински форум.-2006г.
Обхват и структура на работата
Дисертацията е представена на 92 листа машинописен текст, състои се от увод, 3 глави, заключение, заключения, практически препоръки и литературен указател, включващ 53 местни и 103 чуждестранни източника. Работата съдържа 28 таблици, 13 фигури.
Обща характеристика на клиничните наблюдения.
Настоящата работа се основава на анализа на клиничните наблюдения на 138 пациенти с обемни бъбречни образувания, лекувани в урологичната клиника на GKB. С.П. Боткин в периода от 2004 до 2006 г. В зависимост от естеството на тумора, всички пациенти са разделени на 4 круши (таблица 1).
Разпределение на пациентите в групи в зависимост от естеството на тумора
Групи ; Характеристика Количество
1. Пациенти с доброкачествени тумори на бъбреците. , 15-11%
• 2. Пациенти с бъбречни кисти. 18 -13%
! 3. Пациенти с рак на таза и уретера. ! 14 -10%
14. Пациенти с бъбречноклетъчен карцином. 91-66%
Съотношението мъже и жени е - 1:1,4
Методи за определяне на туморна пируват киназа М2-тип.
Ензимът пируват киназа (PK) играе важна роля в клетъчния метаболизъм. Този ензим е получен в кристална форма (молекулно тегло 250 kD) и е добре проучен. Пируват киназата е един от ензимите на гликолизата икатализира прехвърлянето на фосфатна група от фосфоенолпируват към ADP с образуването на АТФ и пируват. При рак в туморни клетки, нормален ПК
замества специален тип от така наречения М2-тип тумор PK, молекула, която има формата на димер (фиг. 1).
Фигура 1. Експресия на туморна пируват киназа M2-тип (Ti M2-PK) в ракови клетки.
Нормален PC M2 тип (висок афинитет към FEP)
Тумор PC M2-тип-Ti M2-RK (нисък афинитет към FEP)
X U Claire, P. Harda, X. E. Eigenbrodg
Считаме за необходимо още веднъж да напомним, че целесъобразността на изследването на Ti M2-RK при рак на бъбреците се основава на факта, че промяната в този ензим е универсална и, както смятат изследователите, е свързана със специален метаболизъм на туморните клетки, включително техния ускорен растеж. Този туморен тип метаболизъм се характеризира с факта, че клетките сякаш "отрязват ъглите" на обмена, за да спестят енергията, необходима за възпроизводството на клетките. В същото време количеството на специална форма на пируват киназа се увеличава в туморните клетки -
тумор тип M2 (Tu M2-RK) и съответно се наблюдава повишаване на нивото му в кръвната плазма.
За определяне на нивото на Tu M2-RK в кръвната плазма е необходима следната материална и техническа поддръжка на метода:
1. Диагностичен комплект реагенти за имунологични изследвания "ScheBo *Tu M2-RK" ("ScheBo Biotech", Германия).
2. Ензимен имуноанализатор-четец за микроплаки, например, регистрационен номер 97/350.98/1412.
3. Стандартно оборудване на клинико-диагностичната лаборатория.
Определянето на нивото на Tu M2-RK в изследваните групи пациенти е извършено в Московския изследователски институт по онкология. П.А. Херцен.
На първо място, нивото на Tu M2-RK се определя само в кръвната плазма, коетополучена в резултат на обработка на венозна кръв на пациента, взета на празен стомах, с 1,5% разтвор на EDHA. Получените EDTA плазмени проби се центрофугират за 15-20 минути при 1500 rpm. Пробите от кръвна плазма могат да се съхраняват при +(4 - 8°) C до 3 дни или до 1 година при -20°C. Преди анализ EDGA плазмените проби се разреждат 100 пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), включен в комплекта. Пробите с концентрации на Tu M2-PK, надвишаващи аналитичния диапазон (по-големи от 100 U/ml), трябва да бъдат допълнително разредени и анализът да се повтори, като се вземе предвид допълнителният фактор на разреждане.
За определяне на нивото на Tu M2-RK с помощта на специфични моноклонални антитела в EDGA плазмени проби се използва ензимен имуноанализ, базиран на тестовата система ScheBo *Tu M2-RK (ScheBo Biotech, Германия), който открива димерната форма на тумор-асоциираната пируват киназа. Анализът е високочувствителен метод ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ), базиран на използването на две моноклонални антитела (mAbs), специфични за Tu M2-PK антигена, а не
кръстосано реагиране с други изоформи на пируват киназа (типове L, R, M1).
Първият етап - антигенът Ti M2-RK, изследван в плазмата, се свързва със специфични mAbs, имобилизирани върху повърхността на полистиролова микроплака.
Вторият етап - добавените биотинилирани mAbs срещу Ti M2-RK се свързват с комплекса антиген-антитяло.
Третият етап - добавя се стрептавидин, конюгиран с пероксидаза от хрян (HRP). Последният етап е добавянето на хромогенен субстрат (тетраметил бензидин, TMB), чието разрушаване се катализира от ензима пероксидаза от хрян, който е част от комплекса, имобилизиран върху повърхността на плочата. Резултатът е продукт със син цвят.окислен субстрат. След 15 минути реакцията се спира с 0,5 М сярна киселина, цветът на продукта става жълт. Абсорбцията на всяка проба се измерва фотометрично с помощта на четец за микроплаки с 450nm и 620nm филтри. Концентрацията на антиген Ti M2-RK в изследваните проби от EDTA плазма се определя с помощта на калибровъчна крива, построена по стандарти с известни концентрации на Ti M2-RK.
Съдържанието на маркера в тестовите проби се изчислява, като се вземе предвид факторът на разреждане на EDTA плазмата (1:100).
Тестовата система включва:
1. Оголена полистиролова микроплака с ямки, покрити с mAb към Ti антиген M2-PK-1 плака за 96 ямки (12 ленти по 8 ямки) в запечатана торбичка със сушител, което позволява анализиране на до 42 проби в два екземпляра.
2. Концентриран FSB, pH 7,2 с консервант (натриев азид).
3. Разтвори на стандартни препарати на Ti M2-RK (в серум с консервант) с различни концентрации (5,0; 15,0; 40,0 и 100,0 U/ml) за построяване на калибровъчна крива.
4. Контрола - разтвор на антиген Ti M2-RK с известна концентрация (в серум с добавяне на натриев азид).
5. Втори антитела към Ti M2-RK, конюгирани с биотин.
6. Ензимен конюгат - стрептавидинов конюгат с HRP.
7. TMB субстрат — течен стабилизиран разтвор (3,3'5,5'-тетра-метил бензидин).
8. "Стоп" - разтвор за спиране на ензимната реакция - 0,5М сярна киселина.
Характеристиките на тестовата система за определяне на Ti маркер M2-RK са показани в таблица 2.
Характеристики на тестовата система за определяне на Ti M2-RK
Индикатор Характеристики на тестовата система
MAb антитела, специфични за Ti M2-RK антигена;
, Метод ELISA
Диапазон на измерване, единици/ml 5.0-100
: Продължителност на анализа (час) 3.0
: съотношение между тестове, 5.3
Анализът на данните от изследването е извършен на базата на набор от статистически програми EXCEL XP SP2 и Statistica 6.0.