Генно инженерство - Биомедицинско инженерство - Библиотека по медицина
Генното инженерствое направление на изследване в молекулярната биология и генетика, чиято крайна цел е получаването на организми с нови, вкл. не се срещат в природата, комбинации от наследствени свойства.
В основата на Г. и. са постиженията на молекулярната биология и преди всичко установяването на универсалността на генетичния код (при всички организми включването на едни и същи аминокиселини в изграждащата полипептидна верига на протеина се кодира от еднакви последователности от три нуклеотида във веригата на ДНК). Благодарение на напредъка на ензимологията в генното инженерство се появи възможността за получаване и насочено използване на фрагменти от нуклеинова киселина, изолиране на отделни участъци от полинуклеотидна верига с точност до един нуклеотид и извършване на in vitro синтез на нуклеинови киселини с нови комбинации от нуклеотидни единици.
Промяна на наследствените свойства на организма чрез G. и. се състои в конструиране на нов генетичен материал от различни ДНК фрагменти, въвеждане на този материал в тялото на реципиента, създаване на условия за функциониране на въведения генетичен материал и неговото стабилно наследяване.
Гени или ДНК фрагменти могат да бъдат получени чрез химичен синтез. Този процес обаче е трудоемък и изисква познаване на последователността от нуклеотиди, които изграждатгена.По-ефективен метод е синтезът на структурен ген върху информационна РНК (mRNA) като матрица, използвайки ензима РНК-зависима ДНК полимераза (обратна транскриптаза). Въпреки това, структурните гени в тялото съставляват функционален комплекс с регулаторни елементи, чиито нуклеотидни последователности не се възпроизвеждат в молекулата на иРНК. Следователно този метод не позволявада осъществи синтеза на структурната и регулаторна област на гена в съвкупността, т.е. функциониращ ген като цяло.
Методите за получаване на цял функциониращ ген са разработени за първи път върху бактериални клетки. Тяхната основа е способността на някои плазмиди - малки ДНК молекули, способни да се репликират независимо от бактериалната хромозома - да бъдат въведени в хромозомата на бактериална клетка и след това спонтанно или под въздействието на индуциращи агенти, като UV радиация, отново да преминат в цитоплазмата, като същевременно улавят съседните гени на хромозомата на клетката гостоприемник. В цитоплазмата тези гени се репликират (умножават) като част от плазмидите, които са ги уловили. Фрагмент от генетичния материал на хромозомата на бактериална клетка може да бъде отделен от плазмида. Използването на плазмиди прави възможно получаването на практически всякакви бактериални гени в изолирана форма (вижПлазмиди).
Успехът на Г. и. допринесе за разработването на техники за комбиниране на гени, изолирани от различни източници, в една ДНК молекула. Решаващо при проектирането на такива хибридни или рекомбинантни молекули in vitro беше откриването и производството на специални ензими - рестриктази, които сега служат като основен инструмент за G. и. Рестрикционният ензим "нарязва" молекулата на ДНК в място (сайт), строго определено за всеки конкретен рестриктазен ензим.
До средата на 80-те години. 20-ти век В световната колекция от рестриктази имаше повече от 400 ензима, които "разпознават" около 100 области с различна структура в молекулите на ДНК. С помощта на рестриктази стана възможно да се изолира почти всеки ген под формата на един или повече ДНК фрагменти. Стана възможно да се доставят синтезирани, „проектирани“ и естествени гени с различни регулаторни нуклеотидни последователности, да се заменят, вмъкнат, изтриятнуклеотиди в строго определени участъци от гена, съкращават или допълват. За създаване на хибридни (рекомбинантни) ДНК молекули получените фрагменти се комбинират с векторна ДНК. За целта се използва ензим, който свързва ДНК фрагменти. Функционалната полезност на хибридната ДНК молекула се определя от пренасянето й в реципиентната клетка чрез последващо възпроизвеждане в нея (амплификация) и функциониране. Прехвърлянето на чужд генетичен материал в реципиентните клетки и възпроизвеждането му в тях се осигурява от векторната част на хибридната молекула, докато синтезът на специфичен протеин се осигурява от вградения фрагмент.
Напредъкът на G. и. до голяма степен се дължи на производството на нови специализирани вектори. За клониране (размножаване) на относително малки ДНК фрагменти до 10 хиляди базови двойки се използват плазмидни вектори. ДНК фрагменти до 10-25 хиляди базови двойки се клонират с помощта на вектори, получени от ламбда фага. Хибридният геном на такъв фаг, съдържащ фрагмент от чужда ДНК, е изкуствено „опакован“ в протеинова обвивка и бактериите са заразени с този реконструиран фаг. По време на репродукцията хибридният фаг лизира клетката, образувайки няколко хиляди копия, които се освобождават в хранителната среда. За клониране на ДНК фрагменти до 35-45 хиляди базови двойки се използват космидни вектори, които са хибрид на ламбда фага и плазмидите. Космидите съдържат така наречените COS-фагови ДНК последователности, необходими за опаковане на фаговите геноми в протеинова обвивка, и плазмиден ДНК сегмент, който позволява на космидните вектори да се размножават в бактерии, без да ги лизират. За клониране на малки ДНК фрагменти с дължина до 300-400 базови двойки като вектори се използват производни на фагови геноми с едноверижна ДНК молекула. Въвежда се вектор, носещ чужда ДНКбактериална клетка, където тези хибридни фаги се размножават, без да лизират клетката гостоприемник и „пъпчат“ в културалната среда като вирусни частици с едноверижна ДНК молекула.
Чрез сравняване на структурата на геномните ДНК фрагменти и съответното клонирано ДНК копие (cDNA) се получава важна информация за организацията на генетичния материал, а в случай на наследствени заболявания - за характера на аномалиите в клонирания генетичен материал, следствие от които е това заболяване. Създадени са пълни библиотеки от гени на много микроорганизми, растения и животни (до бозайници и хора). Около 1000 гена и други човешки ДНК нуклеотидни последователности са клонирани и до известна степен проучени.
Възможностите на Г. и. не се ограничават до клониране на ген и получаване на голям брой негови копия. Често е необходимо да се осигури експресията на ген в клетка, т.е. осъзнават съдържащата се в него генетична информация. Ако ген, въведен в бактериална клетка, е получен от бактерии от същия (или близък) вид, тогава е достатъчно да се изолира генът със собствени регулаторни елементи, които контролират експресията. Въпреки това, с няколко изключения, регулаторните нуклеотидни последователности на еволюционно отдалечени организми не са взаимозаменяеми. Следователно, за да се постигне, например, експресия на ген на висши организми в клетки на E, coli, регулаторната област се отстранява от него и структурната част на такъв ген се прикрепя (на определено разстояние) към регулаторната област на бактериалния ген. Значителен напредък в развитието на тази техника беше постигнат след откриването на нуклеазния ензим BAL31, който има уникалната способност да премахва „допълнителни“ нуклеотидни последователности с всякаква дължина от края на ДНК фрагмент. В моментаВ същото време структурните и регулаторните области се изолират отделно с помощта на тези рестриктази, чиито места за "разпознаване" са разположени най-успешно върху полинуклеотидната верига. След това "допълнителните" нуклеотидни последователности се отстраняват и структурната област на гена на по-висш организъм (еукариотен ген) се свързва с регулаторната област на бактериалния ген. По този начин е възможно да се постигне не само експресията на еукариотни гени в бактериални клетки, но, обратно, бактериални гени в клетките на висшите и нисшите еукариоти. Като реципиенти ефективно се използват не само бактериални клетки, но и клетки от висши организми.
С помощта на методите на Г. и. са открити отклонения в структурата на определени участъци от човешките гени, които са причина за наследствени заболявания. Най-често този метод е така нареченият блот анализ. Изолираната клетъчна ДНК се подлага на смилане с рестрикционни ензими, получените фрагменти се разделят по размер с помощта на електрофореза. ДНК фрагменти от същия тип се инкубират с предварително клониран ген (или част от него) или с нуклеотидна последователност, получена чрез химичен синтез, съдържаща радиоактивен етикет. Маркираната ДНК се свързва само с онези фрагменти от анализираната клетъчна ДНК, които имат нуклеотидни последователности, допълващи я (вижтеНуклеинови киселини).Промяна в разпределението и количеството на фиксиран етикет в сравнение с нормата позволява да се прецени пренареждането в анализирания ген или в съседни нуклеотидни последователности.
Местата на "разпознаване" на някои рестрикционни ензими в молекулата на ДНК са неравномерно разпределени, следователно, когато се разцепи от тези ензими, молекулата на ДНК се разпада на множество фрагменти с различна дължина (така наречените рестрикционни фрагменти). Преструктуриране на структурата на ДНК,в резултат на което изчезват съществуващи области на „разпознаване“ или се появяват нови. води до промяна в набора от тези фрагменти, т.е. до появата на полиморфизъм на дължината на рестрикционните фрагменти (RFLP).
G. i. постави основата за нова посока на изследване, наречена "генетика наобратно". Традиционният генетичен анализ се извършва в следната последователност: избира се черта, свързва се черта с генетична детерминанта и локализиране на тази детерминанта по отношение на вече известните. При обратната генетика всичко се случва в обратен ред. От набор от клонирани геномни региони (или cDNA) с неизвестна функция, характеризиращи се с определен RFLP, се изолират тези, които са най-тясно свързани с определена черта. Ако симптомът е наследствено заболяване, чрез идентифициране на тясно свързан полиморфен фрагмент е възможно да се диагностицира това заболяване чрез наличието на една или друга форма на RFLP. Този подход позволи да се разработят методи за ранна пренатална диагностика, идентифициране на носители на патологичен ген в семействата, дори за такива заболявания като хорея на Хънтингтън, болест на Дюшен, кистозна фиброза, природата на генетичните дефекти, при които беше абсолютно неизвестна. След това можете точно да определите позицията на съответния ген върху хромозомата, да изолирате и анализирате не само гена, но и продуктите от така наречената му експресия (mRNA и протеин) в нормални и патологични състояния. Пълната концепция за "генетика наобратно" е успешно приложена в случая на Дюшен, кистозна фиброза.
По пътя на въвеждането в медицинската практика на методите, използвани в G. и., Все още има много трудности от технически ред. Много лаборатории по света активно разработват практически подходящи диагностични методи за генно инженерство инадеждата е, че такива методи ще бъдат използвани в близко бъдеще за вземане на проби от групи с повишен риск от наследствени заболявания.
Практическа стойност на G. и. за медицината се свързва с перспективите за коригиране на наследствени дефекти при хората, създаване и използване на микроорганизми, които са загубили своята патогенност, но са запазили способността си да формират имунитет. Разработени са методи за синтез на антибиотици, аминокиселини, хормони, витамини, ензими и др., Въз основа на използването на микроорганизми, които включват съответните гени.
G. i. позволява не само копиране на естествени съединения и процеси, но и тяхното модифициране, което ги прави по-ефективни. Пример за това е нова линия на изследване, наречена протеиново инженерство.
От практическите постижения на Г. и. най-важните са създаването на производители на биологично активни протеини - инсулин, интерферон, растежен хормон и др., както и разработването на методи за активиране на метаболитни връзки, свързани с образуването на нискомолекулни биологично активни съединения. По този начин се получават производители на редица антибиотици, аминокиселини, витамини, многократно по-ефективни от техните производители, отгледани по традиционните методи на генетика и селекция. g i. Разработват се методи за получаване на чисти протеинови ваксини срещу вируси на хепатит, грип, херпес и шап; реализирана е идеята за използване на комбиниран ваксиниален вирус за ваксинация, в генома на който са вмъкнати гени, кодиращи синтеза на протеини на други вируси (например вируси на хепатит или грип). В резултат на ваксинация с такъв вирус организмът може да развие имунитет не само срещу едра шарка, но и срещу хепатит, грип или други заболявания, причинени от този вирус,чийто протеинов синтез се цитира от вградения ген.
Както всяко постижение на науката, успехите на Г. и. може да се използва не само в полза, но и в ущърб на човек. Специално проведени изследвания показват, че опасността от неконтролирано разпространение на хибридна (рекомбинантна) ДНК не е толкова голяма, колкото се смяташе досега. Хибридната ДНК и бактериите, които ги пренасят, се оказаха много неустойчиви на влиянието на околната среда, нежизнеспособни в човешкото и животинското тяло при случайно проникване. Известно е, че в природата и без човешка намеса съществуват условия, които осигуряват обмена на генетична информация (т.нар. генен поток). Въпреки това, по пътя на случайното проникване на чужда генетична информация в тялото, природата е създала много ефективни бариери. При работа с повечето хибридни ДНК молекули са достатъчни обичайните предпазни мерки, използвани например от микробиолозите при работа с инфекциозен материал. За специални случаи са разработени ефективни методи за биологична защита и физическа изолация на експериментални обекти от хората и околната среда.
Библиография:Маниатис Г., Фрич Е. и Самбрук Дж. Молекулярно клониране (методи на генното инженерство), прев. от англ., М., 1984; Watson J., Tooze J. и Curi C. Рекомбинантна ДНК, прев. от английски, М., 1986.