Имунодиагностика.
Имунодиагностиката е използването на имунни отговори за диагностициране на инфекциозни и неинфекциозни заболявания.
Имунните реакции са взаимодействието на антиген с продуктите на имунния отговор. Във всяка имунна реакция се разграничават две фази:
1) специфичен - поради взаимодействието на антигена с антитялото и образуването на комплекса AG-AT;
Всички имунни реакции се разделят на:
1) прост; участват два компонента (антиген и антитяло);
2) сложни; участват три или повече компонента (антиген, антитяло, комплемент и др.).
В специфичната фаза има бързо специфично свързване на активния център на антитялото с детерминантата на АХ. Неспецифичната фаза се проявява чрез видими физични явления (образуване на люспи, "чадър", линии на утаяване под формата на мътност).
Имунните реакции се използват при диагностични и имунологични изследвания при болни и здрави хора. За тази цел се използват серологични методи (от серум - серум).
В микробиологията и имунологията широко се използват аглутинация, утаяване, реакции на неутрализация, реакции на фиксиране на комплемента, ензимен имуноанализ, имунофлуоресцентен метод, имуноблотинг.
Реакция на аглутинация - РА,при която корпускулните антигени (бактерии, еритроцити) се свързват с антитела, протича в присъствието на електролити.
RA се използва за:
определяне на антитела в кръвния серум на пациента, например с бруцелоза (реакция на Райт, Heddelson), коремен тиф и паратиф (R. Vidal), туларемия, магарешка кашлица;
определяне на патогена, изолиран от пациента;
определяне на кръвни групи.
Използват се различни варианти на реакцията на аглутинация: разширена, приблизителна
Заопределяне на антитела при пациент се поставя в епруветки подробна реакция на аглутинация: към разрежданията на кръвния серум на пациента се добавя диагностикум (суспензия от убити микроби) и след няколко часа инкубация при 37 0 C се отбелязва най-високото разреждане на серума (серумен титър), при което е настъпила аглутинация.
Ако е необходимо да се определи патогенът, изолиран от пациента, поставете приблизителна реакция на аглутинация върху предметно стъкло. Към капка диагностичен аглутиниращ серум се добавя чиста култура на патогена в разреждане 1:10 или 1:20. Наблизо се поставя контрола: вместо серум се прилага капка физиологичен разтвор. Когато в капка със серум и микроби се появи флокулентна утайка, в епруветки се поставя подробна реакция на аглутинация. В същото време се вземат предвид контролите: серумът, разреден с изотоничен разтвор на натриев хлорид, трябва да бъде прозрачен, суспензията от микроби в същия разтвор трябва да бъде равномерно мътна без утайка. При индикативния РА се използват адсорбирани аглутиниращи серуми, от които са отстранени кръстосано реагиращите антитела.
Реакцията на индиректна (пасивна) хемаглутинация (IRHA, RPHA)се основава на използването на еритроцити с AG или AT, адсорбирани на повърхността им, чието взаимодействие със съответните AT или AG от кръвния серум на пациентите причинява аглутинация и с положителен резултат еритроцитите падат на дъното на полистироловата чиния под формата на назъбена утайка. При отрицателна реакция еритроцитите се утаяват на дъното на чинията под формата на "копче". RNHA се използва за диагностициране на инфекциозни заболявания (дифтерия, дизентерия, салмонелоза, туларемия и др.), Определяне на гонадотропен хормон в урината по време на бременност, за откриване на свръхчувствителност към лекарства,хормони.
Реакцията на инхибиране на хемаглутинацията (HITA)се основава на блокада, потискане на вирусни антигени от имунни серумни антитела, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират червени кръвни клетки. RTHA се използва за диагностика на много вирусни заболявания (грип, морбили, рубеола, кърлежов енцефалит).
Реакцията на утаяванее образуването и утаяването на комплекс от разтворим молекулярен антиген с антитела под формата на мътност, наречена утайка. Прави се разлика между реакцията на утаяване на Ascoli за определяне на патогена на антракс AG и реакцията на утаяване на агар за определяне на дифтериен токсин.
Реакция на свързване на комплемента (CSC).За провеждане на реакцията на свързване на комплемента са необходими следните съставки:
1) тестов серум (AT);
2) антиген - мъртва суспензия от патогени на определено заболяване;
RSK е, че когато си съответстват, антигените и антителата образуват имунен комплекс, към който е прикрепен комплемент, т.е. свързване на комплемента от комплекса антиген-антитяло. Ако комплексът антиген-антитяло не се образува, тогава комплиментът остава свободен. CSC се провежда в две фази: 1-ва фаза - инкубиране на смес, съдържаща три компонента антиген + антитяло + комплемент; Индикатор за 2-ра фаза - откриване на свободен комплемент в сместа чрез добавяне към нея на хемолитична система, състояща се от овчи еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ антитела към тях. При положителна реакция, поради свързването на комплемента с комплекса антиген-антитяло, няма да настъпи хемолиза на еритроцитите и те ще се утаят на дъното на епруветката под формата на "чадър". В отрицателни случаи не се осъществява свързване на комплемента към комплекса антиген-антитяло, той остава свободен исе присъединяват към комплекса еритроцит-хемолитичен серум, като по този начин причиняват хемолиза на еритроцитите. RSK се използва за диагностициране на много инфекциозни заболявания, по-специално сифилис (R. Wasserman), тиф и др.
Реакцията на неутрализациясе провежда чрез въвеждане на смес антиген-антитяло на лабораторни животни. Например, за откриване на ботулинов токсин, бели мишки се инжектират подкожно или интраперитонеално с екстракт от хранителни остатъци (гъби) с антитоксични ботулинови серуми от типове A, B, C, E. Серумът се получава от кръвта на коне или говеда, хиперимунизирани с ботулинови токсини. При отсъствието на увреждащия ефект на микроорганизмите и техните токсини при животните (мишката остава жива), те говорят за неутрализиращия ефект на имунния серум и следователно за специфичността на взаимодействието на комплекса AG-AT.
RIF имунофлуоресцентна реакция (метод на Coons).
Директният RIF метод се основава на факта, че тъканните антигени или микробите, третирани с имунни серуми с антитела, белязани с флуорохроми, могат да светят в UV лъчите на луминисцентен микроскоп. Бактериите в намазка, обработена с такъв светещ серум, светят под формата на зелена граница. Този метод е експресен диагностичен метод за откриване на микробни антигени или антитела.
Имуноензимен анализ (ELISA).Принципът на метода е следният: върху твърдофазен носител (повърхността на ямките на полистиролова плака) се фиксира антигенът на инфекциозния агент, антителата към който трябва да бъдат открити. Антиген, имобилизиран върху повърхността на твърд носител, се нарича имуносорбент. По време на инкубацията на имуносорбента с тестовия серум, ако той съдържа антитела към този антиген, те се свързват в комплекса "антиген-антитяло". След това следваинкубация с ензимно белязани антитела срещу човешки имуноглобулини (конюгат), по време на която повърхността на носителя е прикрепена към комплекса от антитела, белязани с ензима (като ензим най-често се използва пероксидаза от хрян). Конюгатът се получава на базата на поликлонални антивидови антитела, например заешки антитела или моноклонални антитела, насочени срещу човешки имуноглобулини от определен клас M, G, A. Впоследствие, когато се добави субстратът, той взаимодейства с ензима, което води до цветна реакция, чийто интензитет зависи от количеството на свързаните серумни антитела. Когато се използва пероксидазен конюгат, водородният пероксид се използва като субстрат в комбинация с ортофенилдиамин. Резултатите от реакцията се оценяват спектрофотометрично с извеждане на цифрови данни, което изключва субективността на оценката на антителата. ELISA се използва за диагностика на вирусни, бактериални и паразитни заболявания, по-специално за диагностика на HIV инфекции, хепатит В, цитомегаловирусна инфекция, херпес, токсоплазма, както и определяне на хормони, ензими, лекарства и други биологично активни вещества.
Имунен блотинг.В България текущата стандартна процедура за лабораторна диагностика на ХИВ инфекция е откриването на антитела срещу ХИВ, последвано от потвърждаване на тяхната специфичност в имунен блот тест. Откриването на антитела срещу ХИВ включва две стъпки. На първия етап се открива общият спектър на антителата (ELISA), на втория етап се определят антителата към отделни протеини на вируса, имобилизирани върху нитроцелулозна мембрана, чрез имуноблотинг. Протеините на обвивката на вируса HIV1, наричани гликопротеини ("gp" GPI) с молекулно тегло, изразено вкилодалтони: 160cd, 120cd, 41cd. В HIV2 гликопротеините имат тегло 140 kd, 105 kd, 36 kd. Ядрените протеини (gag), наричани протеини ("p" pi) в HIV1 имат молекулно тегло съответно 55kd, 24kd, 17kd, а HIV2 - 56kd, 26kd, 18kd. Резултатите се интерпретират като положителни, при които се откриват антитела срещу 2 или 3 HIV гликопротеина. Серумите се считат за отрицателни, ако не се открият антитела към някой от протеините.