Използването на глицерин за защита на трипанозомите от ниски температури
Polge и Soltis прегледаха съществуващите методи за съхранение на трипанозомите в замразено състояние, за да видят дали тяхното оцеляване може да бъде подобрено чрез промяна на състава на суспензионната смес, добавяне на глицерол или друго неутрално съединение към подходящата среда или промяна на скоростта на охлаждане.
Бяха проведени предварителни експерименти с Trypanosoma brucei "O" в хепаринизирана кръв, взета от мишки в разгара на инфекцията. Кръвните проби бяха разредени с 8 различни чисти разредители и същите разредители, но с добавяне на 5, 10 или 20% глицерол. Бяха приготвени три проби от трипанозоми във всеки от 32 разредителя (0,5 ml всеки) и запечатани в обикновени епруветки. Първата проба беше бързо замразена чрез потапяне в смес от алкохол и въглероден диоксид при температура от -79°. Вторият беше замразен на две стъпки, както е препоръчано от Wapeman и McAllister, чрез потапяне на епруветките за 2 минути в смес при температура от -15°C и след това прехвърлянето им в баня с температура от -79°C. Третата проба бавно се охлажда до -79° по същия начин, както при експериментите с говежди сперматозоиди. До температура от -20° скоростта на охлаждане беше 2° в минута, а след това (от -20 до -79°) се увеличи до 5° в минута. След съхранение на епруветките в продължение на една седмица при -79°C, те бяха размразени и изследваното съдържание беше изследвано.
микроскоп за определяне на броя на мъртвите и живите микроорганизми. Резултатите от изследването показват, че в разтвора на Alsever голям процент от трипанозомите преживяват бързо замразяване при -79° в отсъствието на глицерол, но в конски серум, разтвор на Рингер, натриев цитрат или цитратно-жълтъчна среда, процентът на оцелелите организми е по-нисък. Броят на микроорганизмите, при които подвижността е възстановена след замразяване и размразяване в отсъствие на глицерол, намалява с двустепенно охлаждане или с бавноохлаждане до -79°. Обратно, в среда, съдържаща глицерол, се наблюдава слабо възстановяване на подвижността при бързо охлаждане и много по-добро при бавно охлаждане. Независимо от наличието или отсъствието на серум в средата, около 80% от микроорганизмите оцеляха при бавно охлаждане, когато 5-10% глицерол беше добавен към разтвора на Alsever или Ringer.
Проби от три щама на T. brucei, T. rhodesiense "B", T. congolense "V" и T. gambiense "H" се охлаждат до -79° в разтвор на Alsever, съдържащ серум и в същата среда, допълнена с 10% глицерол. След два месеца съхранение, пробите се размразяват и се инжектират в мишки. Вирулентността на трипанозомите не се е променила, съдейки по интервала от време между ваксинацията и смъртта на животните. След 8 месеца съхранение при -79°, пробите от T. brucei са толкова вирулентни, колкото и тези, които не са били замразени. Резултатите от допълнителни експерименти показват, че колкото по-висока е температурата, толкова по-кратък е периодът, през който T. brucei оцелява при съхранение в замразено състояние, особено в среда, лишена от глицерол. Така, в отсъствието на глицерол, нито една трипанозома не оцелява след съхранение в продължение на 3 дни при -20°C. Повечето от микроорганизмите загиват на следващия ден. Когато към сместа се добави 10% глицерол, 40% трипанозоми оцеляха 3 дни и 10% оцеляха 7 дни при -20°C. Максималната продължителност на периода, през който трипанозомите оцеляват при съхранение при -40° в присъствието на 5 или 10% глицерол, е 14 дни. При температура от -79°C и при всяка концентрация на глицерол, 80% от микроорганизмите остават подвижни след съхранение в продължение на 250 дни. Неустойчивостта на различни щамове на T. brucei към лекарства и антитела се променя след 8 месеца съхранение при -79° в среда, съдържаща 10% глицерол.
На практика проблемът със съхраняването на живи трипанозоми от различни видове за по-нататъшно експериментиране беше решен чрез използване на среда, съдържаща 5 или 10% глицерол, бавно охлаждане до -79 ° C и съхраняване при тази температура. Polge и Soltis също тестват ефекта на други неутрални вещества върху активността на трипанозомите при нормална температура и след кратки периоди на охлаждане до ниски температури. Ацетамидът е токсичен при всяка температура, докато метанолът е токсичен и смъртоносен при температури под -30°C. Трипанозомите, суспендирани в 0,94% разтвор на натриев хлорид, съдържащ 10% серум, губят подвижност и умират, когато се добавят 0,75% глюкоза, 10% ксилоза или 15% захароза. Когато се претеглят в дестилирана вода, съдържаща 10% суроватка и 7,5 или 10% захари, 90-100% от микроорганизмите запазват висока активност при стайна температура дори след излагане на -40°C за 5 минути. Процентът на оцелелите клетки спадна рязко, когато суспензията в захарния разтвор беше бързо замразена при температури под -40°C. В същото време 90% от трипанозомите, суспендирани в 10% воден разтвор на конски серум, съдържащ 10% глицерол, 7,5% ксилоза, 7,5% глюкоза или 10% захароза, оцеляват при въздействието на температура от -79°C, ако преди това са били замразени за 2 минути при -20°C или -30°C.
Проведените експерименти са особено интересни в смисъл, че, както се оказа, трипанозомите са по-способни да понасят захари в отсъствието на натриев хлорид и са по-устойчиви на бързо охлаждане от сперматозоидите на бик. Разрушителният ефект от бързото охлаждане до -79 ° в присъствието на захари може да бъдебеше предотвратено чрез предварително краткотрайно охлаждане при температура от -20 или -30 °. Понастоящем механизмът на защитното действие на захарите при тази охлаждаща техника все още не е ясен. Разтворите не съдържат електролити, така че не могат да действат като буферни системи. В бъдеще е необходимо да се разбере дали е възможно да се извърши лиофилизация на трипанозомите, без да се губи тяхната жизнеспособност, като се приготвят суспензии в среда, съдържаща едно от онези съединения, които предпазват тези протозои от увреждане по време на замразяване и дали сушенето може да се извърши при такава температура, при която увреждането по време на сублимация на лед във вакуум трябва да бъде минимално.