Изсушете на въздух утайката ДНК и я разтворете в 20 µl TE буфер.
Бележки Съдържанието на общата ДНК в левкоцитите е 30–60 µg/ml кръв.
Винаги трябва да се добавя сол към пробата преди фенолната депротеинизация, т.к
Екстракцията с фенол с ниско съдържание на сол може да намали добива на ДНК поради загуби.
Tris-хидрохлорид (Tris-HCl) е включен в много буферни разтвори, тъй като Tris не позволява развитието на микрофлора в такъв буфер в сравнение с други буферни системи. Основен (от англ. stock - запас) концентриран разтвор на кисела сол Tris-HCI с желаната стойност на pH се получава чрез титруване на трис-база (Tris-OH, трис(хидроксиметил)аминометан) със солна киселина.
Изолиране на ДНК от растителни тъканиЕфективното разрушаване на клетъчните стени е важен фактор при изолирането на ДНК от растителните тъкани. Много методи, използвани за това, водят до тежка фрагментация на ДНК (поради хидродинамични прекъсвания в нишката!). Често е необходимо да се намери компромис между размера на ДНК и нейния количествен добив, тъй като ДНК молекулите са най-големите полимерни биомакромолекули. Освобождаването на високомолекулна ДНК от клетките е само част от задачата, тъй като растителните екстракти съдържат големи количества протеини, полизахариди, танини и пигменти, които в някои случаи са много трудни за отделяне от ДНК.
Растителните тъкани обикновено се унищожават чрез механично смилане в присъствието на детергенти, които разтварят клетъчните мембрани и хелатиращи агенти, които потискат действието на клетъчните нуклеази чрез свързване на двувалентни катиони. Протеините на DNP комплекса се отстраняват чрез фенолна депротеинизация на пробата. Някои техники за освобождаване на ДНК от хроматиновите протеини включват използването на протеинази. След депротеинизацията лекарството е неподвижносилно замърсени с полизахариди.
Ако е необходимо голямо количество чиста ДНК, тогава пробите се пречистват чрез ултрацентрофугиране в градиент на плътност на цезиев хлорид.
Често срещани са методи, използващи два детергента CTAB (цетил триметил амониев бромид) и SDS (натриев додецил сулфат). Методът CTAB (Rogers and Bendich, 1985) прави възможно получаването на растителни ДНК препарати с чистота, достатъчна за PCR, рестрикционен и хибридизационен анализ. CTAB разтваря добре клетъчните мембрани.
В допълнение, използването му позволява разделянето на ДНК и полизахаридите, тъй като те се различават по разтворимост в присъствието на това повърхностно активно вещество. При високи концентрации на соли нуклеиновите киселини образуват стабилни, но разтворими комплекси с CTAB. Когато концентрацията на сол падне под 0,4M NaCl, комплексите CTAB/нуклеинова киселина се утаяват, докато повечето от полизахаридите остават в разтвор. Утайката се разтваря отново в 1М разтвор на NaCl с високо солев разтвор и ДНК се утаява с алкохол.
Друга техника също така включва използването на детергенти, по-специално SDS, който също разтваря биомембраните и бързо денатурира протеини (инактивиращи нуклеази). По-долу е дадена модификация на един от тези методи, първоначално разработен от Delaporte et al. (Dellaporta et al., 1985). Протеините и полизахаридите в растителните екстракти при 0 C образуват комплекси с SDS и се утаяват, докато нуклеиновите киселини остават в разтвор. ДНК с високо молекулно тегло, впоследствие пречистена от протеини с фенол, утаена с алкохол и разтворена в подходящи буфери, е подходяща за рестрикция и PCR.
Метод 1. Пригответе проба от 200 mg листа от растения, предварително замразени при –20 C вфризер. Или бързо замразете пробата в течен азот.
2. Пробите се стриват в предварително охладен порцеланов хаван до хомогенност. Ако няма течен азот, тогава при триене на замразени листа добавете 0,1 g алуминиев оксид или калциниран бял речен пясък като абразив. В същото време към разтвора трябва да се добави малко буфер за ДНК екстракция (300 µl).