Клетъчни култури за производство на протеини

Напоследък все повече нараства нуждата на обществото от разнообразни протеинови препарати. Използването на фармацевтични протеинови препарати в диагностиката и лечението на заболявания при хора и животни нараства с особено бързи темпове. Това са не само антитела и техните производни, но и много протеини от човешка кръв (цитокини, хормони на растежа, интерлевкини, интерферони и др.).

На съвременния пазар има около сто лекарства, базирани на човешки протеини, и този брой нараства от година на година. Всички тези протеини се произвеждат in vitro с помощта на генетично модифицирани клетъчни култури, главно бактериална култура на Е. coli, дрожди Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris или клетъчни култури от бозайници.

Досега бактериалната система остава най-рентабилната и добре характеризирана система. Въпреки това, поради прокариотния тип на тази система, еукариотните протеини се обработват слабо в нея и производството в нея е ограничено до прости структури (пептиди, малки протеини), където пост-транслационните модификации отсъстват или не са необходими за биологичната функция.

В допълнение, високото ниво на синтез често води до агрегиране на рекомбинантни протеини под формата на слабо разтворими тела на включване, което налага етапа на ренатурация на рекомбинантния протеин, за да се превърне в биологично активна форма. Също така необходима стъпка е отстраняването на бактериалните токсини, присъстващи в тази система. В същото време общата производителност на бактериалната система остава доста ниска - 0,1-1,5 mg/l.

Ситуацията може да се подобри чрез използване наметилотрофни дрожди P. pastoris като експресионна система. Производството на протеин в дрождите може да достигне до 6,4 g/L, но обикновено е в диапазона от 100-200 mg/L. Въпреки тези ограничения, 43% от рекомбинантните протеини на пазара се произвеждат в бактерии или дрожди.

Повечето фармацевтични биотехнологични продукти обаче се произвеждат в различни клетъчни култури от бозайници, например NSO, BNK, CHO. Като типове, които са най-близки до човешките клетки, тези системи дават високо ниво на производство на функционални рекомбинантни протеини с правилно N-гликозилиране и други пост-транслационни модификации. Нивото на производство на клетъчни култури от бозайници е приблизително 1-3 g/L. Този „златен стандарт“ изисква скъпа инфраструктура и компоненти на околната среда.

Освен това съществува риск от вирусно или онкогенно замърсяване. Всичко това води до свръхвисока цена на крайния продукт, варираща приблизително от 0,3 до 10 хиляди долара. САЩ на грам, в зависимост от количеството синтезиран протеин и необходимостта да се търсят по-евтини алтернативи за производството на целевия протеин, който може да бъде цели трансгенни растения или животни.

Растителни клетъчни култури. Растенията винаги са били основният източник на биопродукти за хората, снабдявайки населението с храна, фибри, дървесина и лекарства. В областта на фармацевтиката растенията се използват за получаване на огромен брой вторични метаболити с различни терапевтични ефекти: заздравяване на рани, антимикробни, противовъзпалителни, психоактивни и т.н. Растенията са развили тези вещества по време на еволюцията, за да се предпазват от патогени и хищници или да привличат опрашители.

Съвременните биотехнологични методи позволяват производството на тези продуктипо предвидим начин в клетъчни култури от съответните лечебни растения. Понякога това е единственият начин за производство на лекарства в индустриален мащаб, например когато оригиналното растение е трудно за култивиране или е много рядко в природата. Успешните примери включват алкалоиди, паклитаксел (антинеопластичен) и шиконин (антимикробен и противовъзпалителен).

Растителните клетки като еукариотна система имат всички характеристики за производството на биологично активни комплексни протеини. В резултат на това делът на биологично активната форма в общия рекомбинантен протеин, синтезиран от растителните клетки, е много висок. Например, в сравнително изследване на експресията на анти-CEA scFv, тютюневите клетки несъмнено синтезират най-голямото количество функционално активен протеин (92%) от общия рекомбинантен протеин в сравнение с Е. coli (12%) и P. pastoris (40%).

Култури от животински клетки съществуват от 50-те години на миналия век. от миналия век, когато HeLa клетки и СНО клетъчни линии са изолирани в клетъчна култура. Повече от петдесет години развитие позволиха производството на животински клетъчни култури да постигне изключителен успех. По данни от 2007 г. приблизително една шеста от най-популярните лекарства са биотехнологични продукти. Девет от десетте най-добри биотехнологични лекарства, продавани в САЩ, са произведени в клетъчна култура от бозайници, а най-малко 23 протеинови лекарства имат продажби над един милиард долара.

Системи за експресия на дрожди

Дрождите са много привлекателна експресионна система, която съчетава ниската цена на прокариотното култивиране с обработката на еукариотния протеин. Система за експресия на дрождиима следните предимства. Първо, дрождите са едноклетъчни организми, чиято генетика и физиология са подробно проучени и които могат да се отглеждат както в малки лабораторни колби, така и в индустриални култиватори.

Второ, няколко силни промотора на тези дрожди са изолирани и характеризирани и естествените така наречени β-плазмиди могат да бъдат използвани за ендогенни експресионни векторни системи на дрожди. Трето, голям брой пост-транслационни модификации се извършват в клетките на дрождите. Четвърто, много малко от собствените протеини на дрождите се секретират в средата; по този начин, ако хетероложен протеин се секретира от клетката, неговото пречистване няма да бъде трудно.

Пето, тъй като дрождите се използват в хлебопроизводството и пивоварството в продължение на много години, Администрацията по храните и лекарствата на САЩ включи обикновената хлебна мая Saccharomyces cerevisiae в списъка си с „организми, признати за безопасни“. По този начин използването на тези организми за получаване на протеини, използвани в медицината, не изисква допълнителни експерименти, необходими при работа с микроорганизми, които не са одобрени за употреба. Някои от протеините, синтезирани в S. cerevisiae, вече се използват като ваксини, фармацевтични продукти и диагностика.

В клетките на дрождите само секретираните протеини са гликозилирани; следователно трябва да се използват секреторни системи за получаване на рекомбинантни протеини, които трябва да претърпят N- или O-гликозилиране, за да станат активни. За да направите това, преди cDNA, която кодира протеина, който представлява интерес за изследователя, трябва да поставите така наречения pre-pro-a-factor - водещата (сигнална) последователност на a1 гена на фактора на чифтосванемая.

Синтезираният рекомбинантен протеин може в този случай да бъде ефективно секретиран от дрождите.

За съжаление, протеините на бозайниците претърпяват прекомерно гликозилиране в клетките на S. cerevisiae, което значително променя тяхната имуногенност. Използването на други видове дрожди, особено метилотрофната Pichia pastoris, понякога помага за решаването на този проблем.

Клетки на насекоми и бакуловируси за протеинов синтез

Бакуловирусите заразяват само безгръбначни, включително много насекоми. По време на инфекциозния процес се образуват две от техните форми. Единият е представен от отделни вириони, които се освобождават от заразена клетка гостоприемник, обикновено клетки на средното черво, и са способни да инфектират други клетки на този орган. Вторият се състои от много вириони, затворени в протеинова матрица. Протеинът на тази матрица се нарича полиедрин, а самата структура се нарича полиедър.

Синтезът на полихедрин започва 36-48 часа след заразяването и продължава 4-5 дни, докато инфектираните клетки се лизират и организмът гостоприемник умре. След това много от тези частици се освобождават и навлизат в околната среда, където протеиновата матрица ги предпазва от инактивиране. Ако такава частица бъде погълната от податлив гостоприемник, полихедринът се разтваря и се освобождават вириони, които са способни да инициират нов инфекциозен цикъл.

Промоторът на полихедриновия ген е изключително силен и цикълът на развитие на вируса не зависи от наличието на самия ген.

Следователно, заместването на последния геном на чужд протеин, последвано от инокулация с получения рекомбинантен бакуловирус на клетъчна култура от насекоми, може да доведе до синтеза на голямо количество хетероложен протеин, който поради сходството на системите за въвеждане на посттранслационни модификации при насекоми и бозайници щеблизки (и вероятно идентични) с нативната форма на целевия рекомбинантен протеин. Въз основа на това са разработени вектори на базата на бакуловируси за експресия на гени, кодиращи протеини на бозайници и животински вируси.

Най-широко използваният вирус е вирусът на множествена ядрена полиедроза Autographa californica (AcMNPV). Този бакуловирус заразява над 30 други вида насекоми и също така расте добре в култура в много клетъчни линии.

Клетъчните линии, които обикновено се използват за работа с рекомбинантен AcMNPV, са получени от гъсениците Spodoptera frugiperda. Полихедриновият промотор в тези клетки е изключително активен и когато те са заразени с див тип бакуловирус, се синтезират големи количества протеин.

Така повърхностният протеин на ХИВ, получен в експресионната система на бакуловирус, е първият протеин, използван за създаване на ваксина срещу СПИН. Но досега тази система не е получила широко разпространение, вероятно поради сложността на процедурата и високата цена на получения продукт.