Клетъчно унищожаване - Наръчник на химика 21
Химия и химична технология
разрушаване на клетките
Първата фаза на биотрансформацията се характеризира с реакции на окисление, редукция и хидролиза. Най-честите реакции са реакциите на окисление. Когато клетките се разрушат, мембраните на ендоплазмения ретикулум с имобилизирани върху тях биотрансформационни ензими образуват микрозоми (сферични структури). В тази връзка окислителната биотрансформация на ксенобиотиците се нарича микрозомално окисление.[c.399]
Преди екстракцията на ензимите суровината се подлага на смилане с цел разрушаване на клетките. За това се използват лабораторни и промишлени мелници (валци, дезинтегратори, дисембратори), както и високо налягане, ултразвук, редуващо се замразяване и размразяване.[c.168]
Смята се, че смъртта на бактериите се дължи на механичното разрушаване на клетките под въздействието на условия, създадени от ултразвук. Нарушаването на жизнените функции на клетката се причинява главно от разпадането на протеиновото вещество на протоплазмата.[c.166]
ИЗТОЧНИЦИ на енергия (органични вещества) 4 - микроорганизми 5 - акцептори на вода (O2. 304. N02, N03) 6 - енергия (топлинна) 7 - ATP енергия 5 - дишане (окислена) 9 - клетъчна маса - клетъчна седиментация // - клетъчно унищожаване /2 - продукти[c.11]
Нишестето се извлича от растенията чрез разрушаване на клетките и измиване с вода. В индустриален мащаб се получава главно от картофени грудки (под формата на картофено брашно), но също и от царевица.[c.401]
Микрозомите (термин, често използван в биохимичната литература) са малки частици с диаметър 50-150 nm, които са фрагменти от главния ER и част от плазмената мембрана. Микрозомите се образуват по време на смилането или хомогенизиранетоклетки. По време на центрофугирането на разрушените клетки първо се утаяват ядрата и други големи фрагменти, а след това митохондриите. При много високи скорости (например при 100 000) микрозомите се утаяват (масата им е 10-10 далтона). Електронните микрографии показват, че в микрозомите фрагменти от мембрани са затворени с образуването на малки торбички, върху чиято външна повърхност са запазени рибозоми[c.33]
Всъщност в непокътнати тъкани ензимът е свързан с мембранни фракции, подобни на лизозоми или вакуоли [37]. Едва след разрушаването на клетките, ензимът и субстратите са един срещу друг. По този начин е достатъчно да се смила картофен клубен при стайна температура, за да се предизвика хидролиза на почти всички мембранни липиди.[c.292]
За да се унищожат клетките, биомасата първо се промива с децимоларен разтвор на захароза (рН 7,3), съдържащ малко буфер, етилендиаминтетраоцетна киселина и албумин. След това се добавят стъклени микробалони и се хомогенизират в дезинтегратор за 1–2 минути при 13 000 rpm. Клетъчните стени и стъклените микрозърна се разделят чрез центрофугиране.[c.202]
Клетките се унищожават с помощта на различни химични, биологични и физични методи. Всички процедури трябва да бъдат достатъчно твърди, за да разрушат клетъчната стена, и в същото време достатъчно меки, за да предотвратят денатурацията на протеина. И тъй като клетъчните стени на различните микроорганизми се състоят от различни полимери, няма универсален метод за тяхното унищожаване.[c.365]
Химическите методи за разрушаване на клетъчните стени включват третиране с основи, органични разтворители или детергенти. Ако протеиновият продукт не се разгражда при pH 10,5 до 12,5, големи количества могат да бъдат лизирани лесно и евтино.бактериални клетки. Например, рекомбинантният човешки растежен хормон е много лесен за изолиране от клетки на E. coli чрез третиране с натриев хидроксид при pH 10. След третиране с алкали почти не остават жизнеспособни клетки, което автоматично решава проблема с изтичането на рекомбинантни микроорганизми. Обработката с органични разтворители е прост и евтин метод за разрушаване на клетките, който се използва за изолиране на ензими от дрожди. Въпреки това, за да сте сигурни, че протеиновият продукт не се денатурира при избраните условия, е необходимо да се проведе предварително тестване. Под действието на детергентите в мембраните на бактериалните клетки се образуват пори, през които протеините и други молекули излизат от клетката. За съжаление детергентите са скъпи, в повечето случаи протеините денатурират в тяхно присъствие и освен това могат да замърсят крайния продукт.[c.365]
След разрушаването на клетките, техните фрагменти се отстраняват или чрез нискоскоростно центрофугиране на големи обеми, или чрез микрофилтрация през мембрана. Протеиновият продукт се утаява от грубия или избистрения лизат с органични разтворители (алкохол или ацетон) или амониев сулфат. Обогатяването, което се постига в този случай е 2-5 пъти. За съжаление, високата цена[c.366]
Какви са предимствата и недостатъците на механичното разрушаване на клетките в сравнение с химическото[c.370]
Трето, много компоненти имат много ниска стабилност. Често задачата е да се изолира един или друг биополимер в нативния, т.е. запазване на биологичната активност, състояние. Междувременно много протеини и високополимерни нуклеинови киселини при умерени температури и леки промени в pH на средата са обект на необратима промяна в конформацията - денатурация, която обикновено е придружена от загуба набиологична активност - инактивация. Освен това клетките често съдържат ензими, които могат да унищожат определени вещества. На първо място, това се отнася за протеини и нуклеинови киселини, тъй като клетките обикновено съдържат ензими, които могат да катализират хидролизата на тези биополимери - протеази и нуклеази. В непокътнати клетки тези ензими са концентрирани предимно в специални гранули - лизозоми. Въпреки това, когато клетките или тъканите са унищожени, което винаги предшества началото на работата по изолирането на вещества, представляващи интерес за изследователя, лизозомите обикновено се унищожават, ензимите се освобождават, което води до бързо унищожаване на биополимери още в първоначалната биомаса.[c.231]
За изследване на структурата, състава и функциите на органелите те се изолират от клетката чрез диференциално центрофугиране след разрушаване на клетката в хомогенизатори (Таблица 2.4).[c.40]
В крайна сметка действието на комплемента води до разрушаване на клетките чрез техния лизис и до активиране на левкоцити, които абсорбират чужди клетки в резултат на фагоцитоза. Освен това комплементът индуцира освобождаването на хемотаксични фактори, които осигуряват движението на полиморфонуклеарни левкоцити към съответната зона (глава 1, раздел E-2). Вниманието на биохимиците е насочено към компонента за разпознаване на комплемента C1, който се състои от 3 протеина, обозначени като lq, C1r и ls. Протеинът lq взаимодейства с СН2-домена на антитела, които са свързали антигени. Въпреки това (Приложение 5-E), активирането на lq изисква поне IgG димер или спонтанен IgM пентамер. Структурата на фактора lq (предполагаемото му тегло е 400 000) е доста необичайна. Централната част на молекулата, която е с диаметър 3-6 nm и дължина 10-12 nm, има шест много тънки свързващи нишки с дължина 10-13 nm и диаметър около 1,5.nm, завършващи с глобули с диаметър nm.[c.387]
За унищожаване на клетките в материала се използва трикратно замразяване, последвано от размразяване или смилане на материала в хомогенизатор със стерилен пясък или стъклени перли.[c.264]
В процеса на изолиране на хромозоми от клетки на етапа на митоза, експериментите се провеждат при ниски температури (-L4°C), като се използват пластмасови пипети, за да се избегне разрушаването на хромозомите. Преди механичното унищожаване на клетките те се суспендират (10 клетки/ml) в хипотоничен разтвор и след това се центрофугират при 2500 g на студено (приблизително 25 минути при 4°C) Хромозома y полето е около 10% от всички хромозоми на донорни клетки. Пречистените хромозоми трябва да се използват в експерименти за прехвърляне към реципиентни клетки (трансфекция) незабавно[c.185]
Напредък. 1. За унищожаване на клетките 2 g мускулна тъкан, нарязана с ножица, се поставя в хаван, добавят се 2 ml 5% разтвор на калиев хлорид и CO2 се смила със стъклен пясък до хомогенно състояние. Продължавайки екстракцията на протеините, добавете още 3 ml разтвор на калиев хлорид и смелете суспензията в продължение на 5 минути, след това отново добавете 5 ml 5% разтвор на калиев хлорид и смелете в продължение на 5 минути.[c.6]
Всяка жива клетка има обвивка или повърхностен слой протоплазма, която има свойството на полупропускливост. И така, черупката на еритроцитите е непроницаема за редица катиони (например за K + и N3 +), въпреки че свободно преминава аниони и вода. Чрез поставяне на животински или растителни клетки в дестилирана вода може да се наблюдава движението на водата в клетките, което води до тяхното набъбване, а след това до разкъсване на мембраните и изтичане на клетъчно съдържимо. Ако в такъв експеримент се използват еритроцити, тогава водата ще стане червена от хемоглобин. Това разрушаване на клеткитеразкъсването на техните мембрани (или повърхностните слоеве на протоплазмата) се нарича лизис, а при еритроцитите - хемолиза.[c.40]
Тъй като сол. във вода, за да се изолират от клетъчната стена, те обикновено се екстрахират с 10% трихлороцетна киселина при 2-4 ° C в продължение на 24 часа, последвано от утаяване с етанол или ацетон. За по-дълго екстракция може да доведе до частична хидролиза на фосфодиестерни връзки или загуба на О-ацилни заместители. Понякога екстрахиран с воден разтвор на NaOH или диметилхидраеин, но при тези условия е по-вероятно частично разграждане на полимера. Li-by-T. разпределете обработката на унищожените клетки с воден фенол. Допълнително почистване се извършва чрез методите на гел хроматография, йонообменна хроматография, високоволтова електрофореза върху хартия и афинитетна хроматография върху лектини.[c.510]
Проензими. Протеолитичните ензими на храносмилателния тракт, както и панкреаса, се синтезират в неактивна форма, под формата на проензими (зимогени). Регулирането в тези случаи се свежда до превръщането на проензимите в активни ензими под въздействието на специфични агенти или други протеиназни ензими. Така трипсинът се синтезира в панкреаса под формата на неактивен трипсиноген. След като влезе в червата, той се превръща в активен трипсин в резултат на автокатализа или под действието на други протеинази (механизмът на активиране е разгледан подробно в глава 12). Трансформацията на неактивен пепсиноген в активен пепсин става автокаталитично в резултат на специфична ограничена протеолиза в присъствието на солна киселина и също така е свързана с разцепването на специфичен пептиден инхибитор от проензима. Тези трансформации на зимогени в активни ензими са свързани с конформационни промени в ензимната молекула и образуването на активния център или неговото отваряне.(демаскиране). Синтезът на протеинази в неактивна форма и редица други неактивни прекурсорни протеини очевидно има определен биологичен смисъл, предотвратявайки разрушаването на органните клетки, в които се образуват проензими. Примери за такова активиране на протеини са активирани[c.153]
Топковите мелници обикновено се използват за унищожаване на голям брой клетки. Концентрираната клетъчна суспензия се излива в камера на високоскоростна топкова мелница, пълна с инертен абразивен материал (напр. стъклени перли с диаметър).[c.114] [c.183] [c.511] [c.333] Гледайте глави в:
Методи на общата бактериология T.3 (1984) - [c.138, c.148]