МЕДИЦИНСКА ГЕНЕТИКА - Стр.14
Въвеждането на молекулярни технологии в комбинация с използването на флуоресцентни оцветители драстично повишава разделителната способност на цитогенетичния анализ. В същото време отделни сегменти от хромозоми могат да бъдат боядисани в различни цветове, а кариотипите като цяло изглеждат като фантастични невероятно цветни картини. Разработени са и методи за оцветяване на хромозоми в клетки в покой, когато хромозомите са максимално разтегнати. С тяхна помощ могат да се идентифицират хромозомни сегменти с размер около 50 килобази.
2.2.5. Биохимични, имунологични и микробиологични методи
Биохимичните и имунологичните методи се основават на анализа на различни класове органични и неорганични съединения, които са дефектни при различни наследствени заболявания, предимно при наследствени метаболитни заболявания. Биохимичните нарушения обикновено са
предхождат появата на клиничните симптоми на заболяването и са по-постоянни в сравнение с тях. Обект на биохимична диагностика могат да бъдат протеини, аминокиселини, въглехидрати, липиди, метални йони и др., както и техните метаболити. В същото време могат да се изследват различни тъкани и секрети на тялото (кръв, урина, слюнка, пот, цереброспинална течност, амниотична течност, биопсии на мускули, кожа, черен дроб и други специализирани тъкани). Биохимичните методи играят основна роля в диагностиката на наследствените метаболитни нарушения. В някои случаи те позволяват идентифицирането на хетерозиготни носители на мутации. Ролята на биохимичните методи за анализ е много важна при масовия скрининг на бременни или новородени с цел ранно откриване на наследствени заболявания.
Ключова роля в патогенезата на всяко моногенно заболяване принадлежи на първичния биохимичен дефект - товапротеин, кодиран от мутиралия ген. Идентифициране и анализ на първичния биохимичен дефект, определяне на първичната патологична метаболитна верига - това са основните цели на биохимичната генетика, решението
което е в основата на разработването на патогенетични методи за профилактика и лечение на наследствени заболявания.
Също толкова важна е ролята на биохимичните методи в диагностиката на вторичните заболявания. Например първичният биохимичен дефект при мускулната дистрофия на Дюшен/Бекер е дефицит на дистрофин, протеин, който свързва цитоскелета на мускулната клетка с извънклетъчния матрикс. В резултат на това нарушение в кръвта на пациентите се повишава нивото на един от мускулните ензими креатинфосфокиназа,
както в началото на заболяването, така и в напреднал стадий. Освен това,
Разнообразието от биохимични методи е огромно и те непрекъснато се усъвършенстват. Те се делят на качествени, количествени и полуколичествени. Качествените реакции позволяват да се открие прекомерно количество междинни метаболити, които се натрупват при наследствени метаболитни заболявания в резултат на блокиране на ензимна реакция. Те са прости, евтини и доста чувствителни. Урината често се използва като субстрат за качествена реакция.
Полуколичествени и количествени изследвания се извършват както на урина, така и на кръв. Най-простите от тях са измерването на пируват, лактат, амониеви йони, измерване на киселинно-алкалния баланс. Водещата роля в диагностиката на наследствените метаболитни заболявания принадлежи на високопрецизните количествени тестове с помощта на флуориметрични методи,
спектрофотометрия, хроматография, електрофореза, масспектрометрия.
Някои методи позволяват едновременното количествено определяне на няколко хиляди метаболитнимаркери. Тези методи обаче изискват използването на доста скъпо оборудване и консумативи.
В някои случаи имунологичните методи за анализ на протеини са по-ефективни от биохимичните. Сред тях трябва да споменем имунохистохимичния метод, който дава възможност да се анализират протеини и да се определи тяхната локализация в специализирани клетки и тъкани на тялото. Имунологичните методи се използват при изследване на пациенти с имунодефицитни състояния (агамаглобулинемия, атаксия-телеангиектазия-синдром на Луис).
Бар и др.), ако има съмнение за антигенна несъвместимост между кръвта на майката и плода, при установяване на бащинство.
Микробиологичните методи се използват за анализ на наличието на определени вещества в биологична проба - аминокиселини, захари и др.
необходими за растежа на определени щамове микроорганизми. Този метод е в основата на добре познатия тест на Guthrie, използван при диагностицирането на фенилкетонурия, хистидинемия, галактоземия и левциноза.
2.2.6. Молекулярно-генетичен метод
Молекулярно-генетичният метод се основава на анализ на нуклеинови киселини, предимно на ДНК молекули. Основната цел на тези методи е диагностиката на мутациите, изследването на тяхната връзка с наследствени заболявания, както и идентифицирането на хетерозиготни и хомозиготни носители на мутации. По същество молекулярната диагностика е най-обективният метод за проверка на наследствените заболявания. Важно е да се подчертае, че установяването на мутации съответно в хомозиготни или хетерозиготни състояния при рецесивни или доминантни заболявания е безспорно потвърждение на диагнозата.
Въпреки това, в случаите, когато мутациите не могат да бъдат открити, решаващото решение при поставянето на диагнозата е запазено заклиницист, тъй като методите за молекулярна диагностика, използвани на практика, най-често не позволяват идентифицирането на всички възможни мутации в изследвания ген.
Въвеждането на молекулярно-генетичната методология в клиничната практика беше улеснено от разработването на метода на полимеразна верижна реакция
(PCR) или специфична ДНК амплификация, настъпила преди повече от 20 години. Откривателят на този метод Кери Мулис е удостоен с Нобелова награда през 1993 г. за изобретението си. PCR методът ви позволява да тествате състоянието на гените в отделни индивиди. Същността му се състои в селективното in vitro копиране на малък генен фрагмент, в който вероятно може да бъде локализирана мутация, с
използвайки геномната ДНК на субекта като шаблон.
Малкият размер на копирания (или амплифициран) генен фрагмент, съчетан с техния огромен брой, дава възможност в бъдеще да се използват много прости методи за анализиране на тази ДНК област и идентифициране на нейните характеристики при изследвания пациент. Основните от тези методи са електрофореза на амплифицирана ДНК, нейното оцветяване, разрязване със специфични ензими - рестрикционни ензими и определяне на нуклеотидната последователност на този фрагмент - секвениране.
PCR е в основата на ДНК диагностиката на всякакви наследствени заболявания. Този подход също така се използва широко за анализ на генетични рискови фактори, предразполагащи към развитието на широко разпространени многофакторни заболявания. В случай на молекулярна диагностика на инфекции се амплифицира ДНК фрагмент,
специфичен за конкретен патоген и след това с помощта на електрофореза и ДНК оцветяване се тества наличието на този фрагмент,
а оттам и самия патоген, в биологичната проба, за която е взетаанализ. Използването на PCR в съдебната медицина се основава на амплификацията на силно вариабилни участъци от генома, позволяващи идентифициране на човек - методът на геномния пръстов отпечатък.
Предимството на ДНК диагностиката в сравнение с биохимичната или имунологичната диагностика е използването на унифициран набор от методи, който практически не зависи от целите на изследването. Това са методи за екстракция на ДНК, PCR, електрофореза, рестрикция на ДНК, хибридизация със специфични ДНК проби и секвениране.
По този начин в рамките на същата лаборатория е възможно да се работи с ДНК-
диагностика на широк спектър от заболявания. Нека се спрем по-подробно на основните методи на молекулярната диагностика.
Изолиране на ДНК. На първо място, трябва да се помни, че по-голямата част от ДНК е в ядрата в състава на хромозомите в свръхусукано състояние поради взаимодействие с определени протеини. По този начин,
ДНК може да бъде изолирана от всеки тип тъкан или клетка, която съдържа ядра. Има много модификации на методите за извличане на ДНК.
Ще анализираме само основните основи на един от тези методи. При
Човешка ДНК най-често се изолира от кръвни левкоцити, за което се вземат от 1 до 5 ml кръв от вената. Кръвта трябва да се вземе в присъствието на антикоагуланти. След утаяване на кръвта се взема слой,
богати на левкоцити, като се добавят детергенти за разрушаване на клетъчната мембрана. Използвайки внимателно центрофугиране, ядрата се отлагат на дъното на епруветката. Супернатантната течност се отцежда и към суспензията на ядрата се добавят детергенти, които разрушават техните мембрани, както и протеолитични ензими, които разрушават протеините. Най-често се използва протеиназа К. Така ДНК преминава в разтвор. На следващия етап е необходимо да се отдели фракцията на макромолекулитеДНК от съединения с ниско молекулно тегло като протеинови фрагменти, липиди,
въглехидрати и др. Един от начините за такова разделяне е екстракция с фенол. Когато се добави фенол и се смеси добре, съединенията с ниско молекулно тегло ще се превърнат във фенол, който ще стане кафяв поради наличието на хемоглобинови фрагменти, а ДНК молекулите ще останат на повърхността на фенола, тъй като не могат да влязат в този плътен разтвор. Бистър разтвор върху фенол, съдържащ ДНК,
се избират и провеждат няколко цикъла на повтарящи се пречиствания с фенол с добавяне на хлороформ в последните етапи. След това ДНК може да се утаи от разтвора чрез добавяне на етанол. При 70 0 алкохол ДНК се утаява във формата
аморфно образувание. В това състояние може да се съхранява дълго време при ниски температури.
Полимеразна верижна реакция (PCR) или специфична ДНК амплификация е селективен in vitro синтез на голям брой копия (от порядъка на един милион) на малък ДНК фрагмент, обикновено с размер стотици нуклеотиди, по протежение на ДНК шаблонна молекула. За PCR е необходимо изкуствено да се синтезират малки едноверижни ДНК молекули с размер от 15 до 30 нуклеотида, комплементарни на краищата на ДНК фрагмента, който се амплифицира. Тези молекули се наричат
грундове. Те служат като "семе" за синтеза на ДНК и следователно определят нейната специфика. PCR се извършва в специални епруветки за еднократна употреба в много малък обем, обикновено не повече от 50 µl. Към този обем от определен буфер се добавя шаблонна ДНК (ДНК на субекта), два вида праймери, изкуствено синтезирани на търговска основа,
допълнителен ензим за синтез на ДНК - термофилна ДНК полимераза,
изолирани от термофилни бактерии и следователно способни да издържат на високи температури и 4 видадезокситрифосфати (dNTP), които служат като градивни елементи за синтеза на ДНК. PCR схемата е показана на фиг. 32.
Фигура 32. Полимеразна верижна реакция (PCR) или специфична ДНК амплификация
На първия етап матричната ДНК се превръща в едноверижна форма чрез нагряване на разтвора над 95 0 за няколко минути. След това три краткосрочни процедури започват да се редуват циклично,
с продължителност няколко десетки секунди: (1) отгряване или кацане на праймери - това се случва, когато разтворът се охлади до температура, която е оптимална за образуване на двойноверижна структура на матрична ДНК с праймери; (2) Синтез на ДНК, започвайки от праймера - това се случва, когато температурата на разтвора се повиши до стойности, които са оптимални за работата на термофилната ДНК-
полимераза и (3) денатурация на синтезираната ДНК - постига се чрез повишаване на температурата на разтвора над 90 0 за преминаване на ДНК в едноверижна форма. След това всичко се повтаря, като се започне от процедура (1). Така при всеки цикъл на температурни промени се получава удвояване на секцията на ДНК, разположена между праймерите, като дължината на тази секция точно съответства на разстоянието между външните краища на праймерите.
След 25-30 такива цикъла броят на новосинтезираните ДНК фрагменти достига или дори надхвърля един милион копия. Изборът на програмата за промяна на температурата и продължителността на всяка от процедурите на цикъла, заедно с избора на праймери и буфер, зависят от дължината и специфичността на ДНК фрагмента, който се амплифицира. Тези параметри определят изкуството на извършването на PCR и много често те се избират емпирично. Температурният цикъл се извършва автоматично в устройство, наречено ДНК усилвател или термичен цикъл. Така PCR е лесен за изпълнение, не скъп, високо точен и модерен метод.молекулярна диагностика.
Има много модификации на PCR, които са удобни за специфични изследвания. Така е възможно едновременното амплифициране не на един, а на няколко ДНК фрагмента - мултиплексно или множествено
PCR позволява преференциален синтез