Механизъм и ензими на репликация
ДНК репликация в еукариоти
Еукаритната ДНК е организирана в нуклеозоми и се намира в хроматиновите влакна. Еукариотната ДНК също се репликира двупосочно, но репликационните вилици се движат 10 пъти по-бавно, отколкото в Е. coli. За да ускорите процеса на репликация, има много източници на репликация (вероятно повече от хиляда). От всяка такава точка две репликационни вилици се движат едновременно в противоположни посоки (фиг. 9), поради което репликацията на цяла еукариотна хромозома може да бъде завършена дори по-бързо от репликацията на бактериална хромозома. Тъй като в една еукариотна клетка има много хромозоми, всички те трябва да се репликират едновременно. По този начин много хиляди репликационни вилици работят едновременно в ядрото на една еукариотна клетка.
Ориз. 9 Еукариотна хромозомна репликация
Разгледайте въпроса за участието на ензимите в репликацията на ДНК.
Ензимът ДНК полимераза I катализира последователното добавяне на дезоксирибонуклеозидни остатъци към края на ДНК веригата с едновременното освобождаване на неорганичен пирофосфат. Уравнението на реакцията е:
където dNMP и dNTP са съответно дезоксирибонуклеозид-5 -монофосфат и дезоксирибонуклеозид-5 -трифосфат. Ако поне един от четирите прекурсора отсъства, тогава не се образува нова ДНК; синтезът на нова ДНК става само в присъствието на четирите прекурсора. 5 -трифосфатите на четирите дезоксирибонуклеозида не могат да бъдат заменени със съответните 5 -дифосфати или 5 -монофосфати. Ензимът също не работи с рибонуклеозид-5 -трифосфати. ДНК полимеразата изисква Mg 2+ йони, за да работи, и нейният активен център съдържа Zn 2+ йон, здраво свързан с ензима.
Синтез на ДНК вериганастъпва в посока 5 → 3 (фиг. 10).
Ориз. 10 Удължаване на ДНК веригата с ДНК полимераза
Енергията, изразходвана за образуването на всяка нова фосфодиестерна връзка в гръбнака на ДНК, се осигурява от разцепването на пирофосфатната връзка в дезоксирибонуклеозид-5 -трифосфатите. След това полученият пирофосфат се разрушава до фосфат. ДНК полимеразната реакция протича само ако в системата вече има известно количество предходна двойноверижна ДНК.
Корнберг и колегите му откриха, че ДНК изпълнява две важни функции в полимеразната реакция - тя служи катосемеиматрица.
ДНК полимеразата последователно добавя нуклеотиди към 3 -края на една от веригите, която служи като зародиш. Следователно, синтезът на нова верига се извършва в посока 5 → 3 . ДНК полимеразата не е в състояние сама да започне синтеза на нова ДНК без семе. Той може само да удължи вече съществуваща верига и дори това може да направи само при наличие на верига, която играе ролята на шаблон.
Нуклеотидите са прикрепени към зародишната верига в съответствие с нуклеотидната последователност на шаблонната верига съгласно принципа на комплементарното сдвояване на Watson-Crick. Където и да се намира тиминов остатък в матричната верига, на това място в дъщерната верига се вмъква аденинов остатък и обратно. По същия начин, ако има гуанинов остатък в шаблонната верига, тогава цитозинов остатък ще бъде вмъкнат срещу него в дъщерната верига и обратно. Така продуктът на ДНК полимеразната реакция е дуплекс с комплементарни сдвоени бази. На фиг. 11 схематично показва ролята на прекурсорната ДНК в ДНК полимеразната реакция.
Ориз. 11 Структурата на предходната двойноверижна ДНК, коятонеобходими за действието на ДНК полимеразата. За да се осъществи синтезът, е необходима една единствена несдвоена нишка, която служи като шаблон. Освен това е необходимо наличието на семенна верига, към която са прикрепени нови нуклеотидни единици.
Тъй като ДНК полимеразата изисква както праймерна верига, така и свободна шаблонна верига, този ензим не е в състояние да репликира цялата естествена хромозома, ако последната е двуверижен пръстен, едноверижен пръстен или непокътнат линеен дуплекс, в който всички бази са сдвоени.
Вече е известно, че за репликацията е необходима повече от ДНК полимераза. В този процес участват повече от 20 различни ензими и протеини, всеки от които изпълнява определена функция. Репликацията се състои от голям брой последователни етапи, които включват разпознаване на произхода на репликацията, размотаване на родителския дуплекс, поддържане на неговите вериги на достатъчно разстояние една от друга, иницииране на синтеза на нови дъщерни вериги, тяхното удължаване, усукване на веригите в спирала и прекратяване на репликацията. Всички тези етапи от процеса на репликация протичат с много висока скорост и с изключителна точност. Целият комплекс, състоящ се от повече от 20 репликативни ензима и фактора, се наричарепликазна система на ДНК,илиреплизома.
Обмислете в общи линии основните етапи на процеса на репликация.
Клетките на Е. coli съдържат три различни ДНК полимерази, означени I, II, III (Таблица 3).
Таблица 3 Характеристики на Е. coli ДНК полимерази
В непокътнати клетки на E. coli ДНК полимераза III е отговорна главно за удължаването на ДНК веригата. Функционира като голям комплекс с молекулно тегло
550 000, наречен холоензим ДНК полимераза III (фиг. 12). Този комплекссъдържа в състава си Zn 2+ йон и изисква наличието на Mg 2+ йони за работа. Той също така се нуждае от матрица и семе, без които не може да започне процеса на репликация. Подобно на ДНК полимераза I, тя удължава ДНК в посока 5 → 3 чрез добавяне на нови нуклеотиди към 3 края на праймерната верига.
Ориз. 12 ДНК полимераза III холоензим
И двата ензима, ДНК полимераза I и ДНК полимераза III, имат три ензимни активности. Освен полимеразна активност те притежават 5 → 3 и 3 → 5 - екзонуклеазна активност, т.е. те могат да разцепват крайните нуклеотиди от всеки край на ДНК веригата. Функцията на ДНК полимераза II все още не е известна.
Японският учен Р. Оказаки открива, че по време на репликацията на ДНК на E. coli и други бактерии, по-голямата част от новообразуваната ДНК се намира под формата на малки парченца. Тези части, нареченифрагменти на Оказаки, съдържат приблизително 1000-2000 нуклеотидни остатъци в прокариотите и 150-200 нуклеотиди в еукариотите. Оказаки предполага, че тези фрагменти са къси сегменти от молекулата на ДНК, образувани в резултат на прекъсната репликация и след това свързани помежду си в една верига. Благодарение на това откритие беше възможно да се покаже, че една от ДНК веригите се репликиранепрекъснатов посока 5 → 3 , т.е. в посоката на движение на вилицата за репликация; тази верига се наричаводеща. Друга веригасе синтезира прекъснатос образуването на къси фрагменти също поради добавянето на нови мономери към 3 - край, т.е. в посока, обратна на движението на вилицата за репликация. След това фрагментите на Okazaki се свързват заедно чрез ензими, образувайки втора дъщерна верига, нареченаизоставаща(фиг. 13).
Ориз. 13 Прекъсната репликация на една от ДНК веригите
За синтеза на Okazaki фрагменти са необходими къси РНК сегменти като праймери, комплементарни на шаблонната верига на ДНК. Тази РНК се образува в посока 5 → 3 от ATP, GTP, CTP и UTP от ензим, нареченprimase. Към 3 -края на този къс едноверижен РНК праймер са прикрепени един след друг дезоксирибонуклеотидни остатъци, комплементарни на шаблонната верига на ДНК. Обикновено РНК праймерът се състои само от няколко рибонуклеотидни остатъка, към които след това ДНК полимераза III добавя 1000-2000 дезоксирибонуклеотидни остатъка и в резултат на това се образува фрагмент на Okazaki. Естествено, нуклеотидната последователност на новосинтезирания фрагмент на Okazaki е комплементарна на нуклеотидната последователност на съответния участък от шаблонната верига. След завършване на синтеза на РНК фрагмента на Оказаки, праймерът се отстранява, нуклеотид по нуклеотид, като се използва 5 → 3 - екзонуклеазна активност на ДНК полимераза I. Новият фрагмент на Оказаки се прикрепва към изоставащата ДНК верига с помощта на ензима ДНК лигаза.
Двойната спирала на ДНК е плътно навита структура. Кодиращите бази са разположени вътре в спиралата, така че репликиращите ДНК ензими да могат да "четат" нуклеотидната последователност на шаблона, родителските ДНК вериги трябва да бъдат разделени поне в кратък участък.
Развиването на двойната спирала и поддържането на двете вериги на известно разстояние една от друга, за да могат да се репликират, се извършва от няколко специални протеина (фиг. 14).
Ензимите, известни като хеликази, развиват къси участъци от ДНК точно преди вилицата за репликация. Необходима е енергия, за да се развие ДНК. За отделяне на всяка двойка основиизразходва се енергията за хидролиза на 2 молекули АТФ до АДФ и фосфат. Веднага след като малък участък от ДНК се развие, няколко молекули отДНК-свързващ протеин(DBP) са здраво прикрепени към всяка от разделящите се вериги, което предотвратява образуването на комплементарни двойки и обратното събиране на нишките. Благодарение на това нуклеотидните последователности на ДНК веригите са достъпни за репликационната система. ДНК полимеразата може директно да удължи водещата верига чрез добавяне на нови нуклеотиди към нейния 3 край. Други специфични протеини помагат на праймасата да получи достъп до шаблона за изоставащата нишка. В резултат на това праймазата е в състояние да се свърже с изоставащата верига и да синтезира РНК праймери за Okazaki фрагменти.
Бързото размотаване на родителските ДНК вериги по време на репликация (4500 оборота в минута) поражда друг проблем, който е, че при липса на специално шарнирно устройство, цялата хромозома, разположена пред вилицата за репликация, трябва да се върти с еднаква скорост. Смята се, че една панта в ДНК (точно пред вилицата за репликация) помага на клетката да избегне това, поради което само къс участък от ДНК трябва да се върти с висока скорост. Това може да се постигне чрез кратко прекъсване на една от ДНК веригите, което много бързо и точно се поправя след едно или повече завъртания. Краткотрайните прекъсвания и събирания се осъществяват от ензимитетопоизомерази. При прокариотите топоизомеразата се наричаДНК-гираза.
Ориз. 14 Схематично представяне на основните етапи на репликацията на ДНК
Докато репликативната система поправя прекъсвания в изоставащата верига, тя се движи по репликиращата се ДНК. Две нови вериги се свързват със собствената сикомплементарни шаблонни вериги автоматично, образувайки две дъщерни спирали, всяка от които съдържа една родителска и една новосинтезирана верига. Образуването на нови спирали не изисква нито разход на енергия, нито участието на какъвто и да е "усукващ" ензим.
Механизмът на действие на еукариотните ДНК полимерази е подобен на този на прокариотите. Линейността на еукариотната ДНК причинява проблеми, които не съществуват при прокариотите, които имат кръгова ДНК. За разлика от водещата верига, която се репликира непрекъснато, праймерът (РНК сегмент), разположен в 3 -края на изоставащата верига, се разрушава и не се репликира от ДНК полимеразите. За да се предотврати скъсяването на веригата,теломерите- участъци от нерепликираща се ДНК са разположени в краищата на хромозомата. Праймер може да бъде синтезиран в тази ДНК област и пълнотата на репликацията ще бъде запазена. Теломерът се състои от голям брой повторения, например при хората: TTAGGG. Шаблонът за теломера е РНК и специален ензим теломераза, който е обратна транскриптаза, прикрепя тези фрагменти към 3 - края, за да поддържа оригиналния размер на хромозомата.