Механизми за възстановяване на ДНК - Механизми за оцеляване на бактериите в околната среда - Статии
Радиорезистентността на бактериите се основава на различни вътреклетъчни процеси, участващи в възстановяването на увредена ДНК. Голяма стойност за изследването на тези процеси е наличието на добре охарактеризирани мутантни щамове, чиято радиационна чувствителност варира в изключително широк диапазон.
С помощта на генетични кръстове са получени двойни и тройни дрождеви мутанти, при които репаративната активност напълно липсва. Сравнително изследване на щам от див тип и свръхчувствителни двойни и тройни мутанти на S. cerevisiae показа, че докато нормалният щам доста лесно понася образуването на почти 16 000 димера в ДНК (37% преживяемост), двойните и тройните мутанти остават резистентни в присъствието на не повече от 50 и съответно 1 димер. Намалената устойчивост на такива двойни и тройни мутанти предоставя убедителни доказателства за съществуването на различни пътища за възстановяване на радиационните увреждания.
В зависимост от това дали видимата светлина участва в модификацията на увреждането на ДНК, възстановяването може да бъде разделено на светло и тъмно. По-конкретно, светлинното възстановяване се отнася до феномена на фотореактивация, описан за първи път при актиномицети. Механизмът на фотореактивиране действа само върху пиримидиновите димери. Този процес включва фотореактивиращия ензим, който се свързва с димерите. Полученият ензим-субстратен комплекс се активира от видима светлина, което води до in situ мономеризация на димерите. По този начин леталният ефект на UV радиацията е значително намален, ако откритите клетки след това се изложат на видима светлина с дължини на вълните между 360 и 420 nm (виж Фиг. 6.1).
Фиг. 6.1 Светлинна поправка на ДНК
Фотореактивирането служи като мощенинструмент за изследване на летални и мутационни увреждания, тъй като тяхното възстановяване под въздействието на светлина може да се използва като критерий за вземане на решение дали инактивирането на ДНК се дължи на образуването на пиримидинови димери.
Друг вид клетъчно реактивиране чрез видима светлина е нейният защитен ефект. В този случай се наблюдава увеличаване на преживяемостта на клетките при осветяване с видима светлина преди UV облъчване. Това явление се обяснява с факта, че видимата светлина предизвиква забавяне на клетъчното делене. В резултат на това забавяне остава повече време за възстановяване на щетите, причинени от UV лъчение (виж Фиг. 6.2).
Фиг. 6.2 Зависимост на оцеляването на бактериалните клетки от величината на облъчване
Под "тъмно възстановяване" се има предвид възстановяване без участието на светлина. Понастоящем са известни две системи от този тип: ексцизионно възстановяване и пострепликативно рекомбинантно възстановяване. Първият тип възстановяване изисква наличието на ензими, които разпознават увреждането на структурата на ДНК, премахват засегнатите области, като ги заменят с нормални нуклеотидни последователности и накрая възстановяват оригиналната структура на ДНК, завършвайки полинуклеотидната верига (виж Фиг. 6.3).
Фиг. 6.3 Ремонт на тъмна ДНК
Действието на различни инактивиращи агенти върху клетките може да доведе до появата на редица различни увреждания в ДНК. Подробно проучване на системата за ексцизионно възстановяване стана възможно благодарение на наличието на чувствителни към радиация мутанти, с помощта на които беше възможно да се изолират и характеризират специфични ензими, участващи в различни етапи на този процес. E. coli има поне четири такива етапа. На първия етап веригата на ДНК се разкъсва в близост до увреждането под действието наендонуклеаза, която разпознава нарушения в структурата на ДНК. Тази UV-специфична ендонуклеаза е изолирана от Micrococcus luteus и E. coli. Разкъсването на ДНК веригата е последвано от отстраняване на пиримидиновите димери от екзонуклеаза. Отстраняването на димерите е придружено от допълнително разграждане на ДНК с образуване на празнини с размер от 20 до 400 нуклеотида. След това празнините се запълват с помощта на ДНК полимераза, която използва непокътнатата допълнителна ДНК верига като шаблон. Последната стъпка в тази последователност от събития е възстановяване на целостта на полинуклеотидната верига чрез омрежване на прекъсването с лигаза.
Генно инженерство Възниква през 70-80-те години на 20 век. Генното инженерство е дял от молекулярната генетика, свързан с целенасоченото конструиране на нови комбинации от гени, които не съществуват в природата. ЗАДАЧИ НА ГЕННОТО ИНЖЕНЕРСТВО: дешифриране на структурата на гените, синтезиране на гени.