Метод за диагностициране на лептоспироза при селскостопански животни
Притежатели на патенти RU 2493569:
Изобретението се отнася до ветеринарната медицина. Метод за диагностициране на лептоспироза при селскостопански животни, включващ определяне наличието на антитела срещу антигени от седем серогрупи L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в кръвен серум чрез ензимен имуноанализ, характеризиращ се с това, че антигенни протеини от лептоспири на като антиген се използват три серогрупи, смесени в равни количества - L. tarassovi, L. grippotyphosa и L. hebdomadis. Изобретението значително опростява и съкращава максимално диагностиката на лептоспирозата, позволява осъществяването на оперативен контрол върху епизоотичното състояние на животните по отношение на лептоспирозата. Методът има висока специфичност, чувствителност и стандарт, а също така осигурява създаването на безопасни условия на труд за персонала на диагностичните лаборатории. 4 табл., 4 пр.
Изобретението се отнася до ветеринарната наука, а именно до диагностика на инфекциозни заболявания и може да се използва за диагностициране на лептоспироза при селскостопански животни.
Известен метод за диагностика на лептоспироза, основан на използването на реакция на микроаглутинация - RMA (ГОСТ 25380-91. Селскостопански животни. Методи за лабораторна диагностика на лептоспироза. - Вместо ГОСТ 325386-82; въведен. 1993-01-01. - М.: Издателство на стандартите, 1992. - 30 S.), който е извършва се чрез добавяне на лептоспирозна култура към тестовия серум ke кръв на животно с последващо определяне на титри на лептоспирозни антитела. Живи култури от Leptospira се използват като антигени за откриване на специфични антитела в кръвния серум на животни в RMA. В същото време е задължително да се използва минимум от всеки кръвен серум по време на планирано изследване за лептоспирозаседем антигена (живи серогрупи на лептоспира L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe, L.icterohaemorrhagiae). Лабораторните диагностични щамове на Leptospira се поддържат чрез периодично повторно засяване на всеки 10-15 дни. Реакцията използва култури от Leptospira на възраст 5-10 дни без признаци на аглутинация и лизис с натрупване на микробни клетки от 50-100 милиона / cm 3 .
Известният метод обаче има значителни недостатъци: висока трудоемкост, субективна оценка на диагностичните резултати, невъзможност за стандартизиране на диагностиката, необходимостта да се вземе предвид реакцията само под микроскоп. В допълнение, методът изисква постоянно поддържане на пълен диагностичен набор от живи Leptospira в стабилно състояние, което може да представлява заплаха за здравето на персонала на ветеринарната лаборатория.
Прототипът е метод за откриване на антитела срещу лептоспироза в кръвния серум на прасета с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA), където за получаване на антиген се използват лептоспири от 7 серогрупи: L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe, L.icterohaemorrhagia e (виж Патент България No. 2053513, M PC A61K 39/00 от 27.01.96.). Този метод обаче е трудоемък, т.к. за получаване на антиген е необходимо да се използват лептоспири от 7 серогрупи и този метод не е предназначен за откриване на антитела срещу лептоспироза в други видове селскостопански животни.
Целта на изобретението е да разшири арсенала от методи за диагностициране на лептоспироза, осигурявайки за кратко време с максимална точност и обективност за получаване на резултати, показващи наличието на антитела срещу патогенни лептоспири в кръвните серуми на изследваните селскостопански животни, както и безопасни условия на труд за персоналадиагностични лаборатории.
Проблемът се решава от факта, че в метода за диагностициране на лептоспироза на селскостопански животни, включително метода на индиректна твърдофазова ELISA за откриване на антитела срещу антигени от седем серогрупи на L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe и L.icterohaemorrhagiae в кръвен серум, съгласно изобретението , антигенни протеини, смесени в равни количества, се използват като антиген от лептоспири от три серогрупи - L.tarassovi, L.grippotyphosa и L.hebdomadis. Този метод позволява да се открият антитела срещу лептоспироза в различни видове селскостопански животни.
Методът се осъществява по следния начин.
Плаките от полистирен за ELISA се сенсибилизират с получения антиген за 16-18 часа при 20-22°C, последвано от наслояване на 1% разтвор на BSA с експозиция от 1 час при 37°C и последващо трикратно измиване.
В две ямки на таблетката добавете 100 μl положителна контролна проба (К+), в другите две ямки на таблетката - 100 μl отрицателна контролна проба (К-). В останалите ямки на таблетката добавете 50 μl от буферен разтвор за разреждане на серуми (RBR-C) и 50 μl от тестовите серуми. Разтворът се смесва 5 пъти чрез пипетиране, без да се докосва дъното на ямката.
След вземане на серумни проби, плаката се поставя в найлонов плик или се покрива с капак и се инкубира за 60 минути при 37°C. След инкубиране, ямките се освобождават от съдържанието и се промиват пет пъти с работен фосфатно буфериран физиологичен разтвор с tween (FSB-T).
След промиване, 100 μl от разтвор на конюгат, конюгиран с пероксидаза от хрян (PKg-G) се добавя към ямките на таблетката; таблетката се поставя в найлонов плик или се покрива с капак и се инкубира 30 минути при 37°С.
След повторна инкубация ямките се освобождават отсъдържание и се измива пет пъти с работен разтвор на FSB-T. След промиване, 100 μl от разтвор на хромоген - тетраметилбензидин субстрат (TMB-субстрат) се добавят към ямките на таблетката и се инкубират за 30 минути при 37°C на тъмно. След като изтече определеното време, реакцията се спира чрез добавяне на 50 μl стоп разтвор към всяка използвана ямка.
Оценка на резултатите от реакцията:
Резултатите от ELISA се записват на спектрофотометър. Оптичната плътност (OD) се измерва при дължина на вълната 450 nm. Нулевото ниво ("празно") се задава от въздуха. Изчислете OPcrit. по формулата:
където OPC-(средно) е средната стойност на OP (OPK-) за две дупки.
Ако стойността на оптичната плътност на тестовата проба не превишава ODcrit., тогава пробите се считат за отрицателни за наличие на лептоспирозни антитела към серогрупите L.pomona, L.tarassovi, L.hebdomadis, L.icterohaemorrhagiae, L.grippotyphosa, L.sejroe и L.canicola.
Ако стойността на оптичната плътност на тестовата проба надвишава ODcrit., тогава пробите се считат за положителни за наличие на лептоспирозни антитела към серогрупите L.pomona, L.tarassovi, L.hebdomadis, L.icterohaemorrhagiae, L.grippotyphosa, L.sejroe и L.canicola във всяка комбинация.
Пример 1. Оптималната комбинация от антигенни протеини от различни серогрупи leptospira се определя при получаване на антиген.
For this, antigenic proteins of each of the 5 leptospira serogroups were used separately (antigenic proteins of the L.canicola and L.sejroe serogroups were not separately taken for research, because they have an antigenic structure identical to that of L.icterohaemorrhagiae and L.hebdomadis, respectively), as well as antigenic proteins of seven serogroups mixed in equal amounts.
- № 1 антигенни протеини на L.hebdomadis,
- № 2 антигенни протеини на L.pomona,
- №3 антигененкатерици Л.тарасови,
- № 4 антигенни протеини на L.icterohaemorrhagiae,
- № 5 антигенни протеини на L.grippotyphosa,
- №6 антигенни протеини L.hebdomadis+L.pomona+L.tarassovi+L.grippotyphosa+L.canicola+L.sejroe+L.icterohaemorrhagiae - поливалентен антиген.
За изследване на ELISA с произведени антигени са използвани кръвни серуми на зайци, сенсибилизирани с култури от лептоспири от различни серогрупи. Преди това кръвният серум беше изследван в RMA. Кръвният серум на интактни зайци с отрицателен PMA за лептоспироза се използва като контрола за специфичност (Таблица 1).
Резултатите от изследванията, показани в таблица 1, показват, че при изследване на кръвни серуми на интактни зайци с различни антигени в ELISA, във всички случаи са получени отрицателни резултати, които съвпадат с RMA.