МЕТОД ЗА ФЛУОРЕСЦИРНИ АНТИТЕЛА (MFA)
Целта на урока. Да се запознаят учениците с принципа на метода на флуоресцентните антитела и техниката за създаване на имунофлуоресцентна реакция, с принципа и техниката на провеждане на ензимен имуноанализ.
Оборудване и материали. Инактивирани култури от Brucella и Salmonella, 96% етанол, PBS (рН 7,2. 7,4), „мокра камера“ (Петриеви панички, ексикатор), луминесцентни серуми срещу Brucella, Salmonella, заешки имуноглобулини, положителен серум от Brucella, готов препарат за демонстриране на резултатите от ELISA, луминесцентен микроскоп без аромат .
При тези серологични реакции се използват антитела (имунни серуми), маркирани с флуорохром или ензими, и по-нататък, като се използват специални методи, се записва образуването на комплекс антиген-антитяло. В някои изпълнения на ELISA, ензимен етикет се въвежда в антигена.
Метод на флуоресцентни антитела (MFA). Този комплексен метод съчетава серологична реакция, при която протича специфично взаимодействие на антиген и антитяло за образуване на имунен комплекс, и микроскопско изследване, с което този комплекс се открива.
В реакцията на имунофлуоресценция се използват антитела, към които е прикрепен флуорохром (по-често флуоресцеинът е изотиоцинат). Такива антитела запазват способността да реагират специфично с антигена и поради флуорохрома светят под въздействието на ултравиолетови лъчи. При настройката на MFA микробният антиген се фиксира върху предметно стъкло и се третира с луминесцентни антитела. След това лекарството се промива с вода от несвързани антитела и се гледа под флуоресцентен микроскоп. Ако антителата специфично съответстват на даден антиген, тогава те се образуват с антигенасилна комплексна и флуоресцентна микроскопия разкрива светещи микробни клетки в препарата (фиг. 70).
Предимството на MFA като диагностичен метод е, че може да се използва за серологично идентифициране на микроорганизъм директно в патологичен материал за два до три часа, без изолиране в чиста култура (експресен метод). Подобно на други серологични тестове, MFA също се използва за откриване на антитела в кръвта на животни.
Подготовка на препарат за MFA. При откриване на инфекциозен агент (антиген) се приготвят отпечатъци от органи или друг материал върху предметно стъкло. За откриване на антитела в изследвания кръвен серум се приготвят петна върху предметно стъкло от известен антиген, например причинителя на салмонелоза, антракс и др. Препаратът с приложен материал (бактериална суспензия, отпечатък) се изсушава на въздух и се фиксира с ацетон (5 минути), или етанол (10,15 минути), или метанол (5,10 минути). Препаратът може да се фиксира и чрез нагряване, както при конвенционалната светлинна микроскопия. Отпечатъците от органи и тъкани се третират най-добре с ацетон, охладен до -20 ° C 2,4 минути. В зависимост от конкретните задачи, оцветяването на готовите препарати с луминесцентни серуми се извършва по различни начини.
Директно MFA. Разработено от Coons et al. (1950 г.). Капка луминисцентен имунен серум в работно разреждане, съдържащ антитела срещу желания антиген, се нанася върху предметно стъкло с фиксиран антиген. За да се избегне изсушаване, препаратът се поставя в мокра камера (блюдо на Петри) с филтърна хартия, навлажнена с вода и се държи в термостат при 37,38 °C за 15,30 минути. След това лекарството се промива за 5.10 минути от несвързани имуноглобулини с течаща (чешмяна) вода с рНне по-ниска от 7,0. Промитият препарат се изсушава с филтърна хартия и се микроскопира.
Direct MFA се използва само за идентифициране на неизвестен антиген; неговият недостатък е необходимостта от приготвяне на луминисцентен серум за всеки тип идентифициран микроорганизъм.
Непряко MFA. Използва се в две версии.
Двустепенна MFAе предложена от Weller и Coons (1954). Тази опция се счита за по-универсална, тъй като с помощта на един луминесцентен антивидов серум могат да бъдат открити различни видове микроорганизми.
Капка небелязан имунен серум (серум от първи етап) се прилага върху антигена. Лекарството се държи в термостат за 15,30 минути, след което се измива, за да се отстранят несвързаните антитела от имунния серум, и се изсушава (виж директната версия). Ако серумните антитела от първия етап съответстват на антигена, тогава водата не отмива образувания AG-AT комплекс (антителата се фиксират върху антигена).
Върху изсушения препарат се нанася капка луминисцентен антивидов серум (серум от втори етап) в работен титър. Лекарството се поставя отново в термостат във влажна камера за 15,30 минути, след което се промива с вода и се изсушава. Антивидовият серум е белязано с флуорохром антитяло срещу кръвни имуноглобулини на животинския вид, от който е получен първостепенният имунен серум. Така антителата на първия серум служат като антиген за белязаните антитела на антивидовия серум. В резултат на това антителата от втория етап се прикрепват към комплекса AG-AT, образуван на първия етап, образува се двоен комплекс, който може да бъде открит във флуоресцентен микроскоп.
Универсалността на индиректния вариант се дължи на факта, че като се използва на първия етап, получен от животниот един вид (например от коне) имунни серуми срещу различни микроорганизми, на втория етап, използвайки един антиспециален серум, могат да бъдат идентифицирани неограничен брой патогени на инфекциозни заболявания.
Тристепенният MFA е вариант на RSC върху стъкло. В този случай свързаният комплемент се открива в имунния комплекс върху стъкло с помощта на луминисцентен серум (фиг. 71).
Двустепенна или тристепенна MFA с помощта на известен антиген може да открие антитела в кръвта на животни.
Необходими са контроли, за да се потвърди специфичността на резултатите от MFA. За директния вариант е достатъчна една контрола: антигенно хомоложни и хетероложни микроорганизми се третират с луминесцентен серум. В първия случай се наблюдава луминесценция на бактерии, във втория луминесценцията отсъства.
За индиректния вариант се поставят две контроли: 1) натривки, съдържащи антигенно хомоложни и хетероложни микроорганизми, се третират с антивидов луминесцентен серум. При отсъствие на антитела от първи етап, клетките не трябва да луминесцират; 2) петна с антигенно хомоложни и хетероложни бактерии се третират с имунен (антимикробен) серум (първи етап), последвано от прилагане на флуоресцентен антиглобулинов (антивидов) серум (втори етап). В първия случай се наблюдава специфичната луминесценция на бактериите, във втория отсъства.
Оценка на резултатите от MFA Помислете за яркостта на сиянието, цвета, локализацията и структурата на сиянието. При бактерии, оцветени (третирани) с луминесцентен серум, белязан с флуоресцеин изоцианат, обикновено се наблюдава ярко зелено сияние по периферията на клетката под формата на ръб или ореол, централната частбактериите светят слабо. Този характер на сиянието се обяснява с факта, че няколко пъти повече антитела се проектират върху ретината на наблюдателя от единица площ по периферията на микробната клетка, отколкото от централната й част. Трябва да се има предвид, че при пластмасовите бактерии (лептоспири, вибриони) цялата клетка свети. При клетки, потопени в тъканна течност и при млади антраксни бацили, контурът обикновено не е рязко изразен.
Интензитетът на луминесценция се оценява по системата с четири кръста: 1) (++++) - много ярка флуоресценция по периферията на микробната клетка, ясно контрастираща с тъмната централна част на клетката; 2) (+++) — ярка флуоресценция на клетъчната периферия; 3) (++) - слаб блясък на клетъчната периферия; 4) (+) - липса на контрастен блясък на периферията и централната част на микробната клетка. Липсата на специфично сияние се обозначава със знак минус (виждат се сенки от микроорганизми). При диагностицирането на различни патогени положителният резултат често се счита за специфична луминесценция на бактериални клетки не по-ниска от четири или три кръста.
Ензимен имуноанализ (ELISA). Този метод стана широко разпространен, след като беше решен проблемът с въвеждането на ензимен етикет в антитяло или антигенни молекули. Антителата, свързани с ензима, запазват способността да реагират специфично с хомоложния антиген, докато ензимът запазва способността да взаимодейства със съответния субстрат.
ELISA обикновено се използва в хистохимичен (имунопероксидазна реакция) и твърдофазов вариант.
Хистохимичен ELISA. Този метод обикновено открива микробни антигени в цитонамазки, кръвни натривки и хисторези. Както в случая с MFA, пероксидазната реакция се използва в директен и индиректен вариант.
Директна имунопероксидазна реакция.Asизползва се известен компонент, белязан с пероксидазни антитела срещу всеки патогенен микроорганизъм. Препаратът, например петна за отпечатъци, се фиксира с охладен ацетон (-15.-20 ° C), изсушава се, четири или пет капки от конюгата се прилагат в работен титър (белязани антитела), инкубират се във влажна камера при 37 ° C за 1,2 часа, промиват се с физиологичен разтвор за 15 минути, изплакват се с дестилирана вода, изсушават се, нанасят се върху препарата няколко капки суб. стратен разтвор (25 mg 3,3-DAB • 4HC1 се разтварят в 100 ml 0,05 М Tris буфер рН 7,5 и 25 ml от този разтвор се смесват с 3 ml 0,5% разтвор на водороден пероксид). Препаратът със субстрата се инкубира за 5.10 минути, промива се във физиологичен разтвор за 10 минути, изплаква се с дестилирана вода и се микроскопира.
Ако желаният микробен антиген присъства в тестовия материал, тогава маркирани с пероксидаза антитела специфично се свързват с него. Въвеждането на субстрата в пероксидазата води до образуването на оцветен продукт, видим под микроскоп, първо като сини гранули, а по-късно жълто-кафяви.
Индиректна имунопероксидазна реакция.Както при MFA, се използват маркирани с пероксидаза антитела към видово-специфични имуноглобудини. На първия етап препаратът с тестовия материал, фиксиран с охладен ацетон, се третира във влажна камера при 37,38 ºС за 1,2 часа с имунен серум (0,2,0,3 ml), съдържащ небелязани антитела към желания антиген. След това препаратът се промива с физиологичен разтвор в продължение на 5 минути, изсушава се и се обработва при 37,38 °C в продължение на 1,6 часа във влажна камера с белязани с пероксидаза антитела (конюгат в работно разреждане). Последващите операции и отчитането на резултатите са подобни на директната версия на пероксидазната реакция.
Твърдофазов ELISA. Нанесете най-многоширок. В този случай антителата или антигените се фиксират върху неразтворими носители: микропанели, стъклени или найлонови перли.
При различни варианти на реакция резултатите се вземат предвид инструментално или визуално.
Откриването на антигенсъгласно схемата "сандвич" се състои от следните стъпки.
Ямките на полистиролови микропанели се сенсибилизират с антитела, специфични за желания антиген [2] в концентрация 10,30 µg/ml. Обикновено 0,2 ml разтвор на антитяло в буфер с рН 9,6 се добавя към ямката, държи се при 37 ° С в продължение на 1 час и след това се оставя за една нощ при 4 ° С. Разтворът на имуноглобулина на панела се отстранява и се промива с PBS (рН 7,4) три пъти, за да се отстранят излишните свободни (несорбирани) антитела.
0,2 ml от разтвор, съдържащ тестовия антиген, се добавят към ямките и се инкубират при 37°C в продължение на 2 часа, след което панелите се промиват отново, както е описано по-горе.
Към ямките се добавят 0,2 ml маркирани с ензим специфични антитела (конюгат); панелите се инкубират при 37 °C за 1,2 часа, след което се промиват от несвързани антитела.
0,2 ml разтвор на ензимен субстрат [ортофенилендиамин (OPD) или
5-аминосалицилова киселина - за пероксидаза и р-нитрофенил фосфат - за алкална фосфатаза] и се инкубират на тъмно при 20,22 ºС за 5,30 минути.
Реакцията се спира чрез добавяне на 0,05 ml 2N. разтвор на сярна киселина (за пероксидаза) и 3 М разтвор на натриев хидроксид (за алкална фосфатаза).
Отчитане на резултатите визуално или спектрофотометрично чрез увеличаване на абсорбцията при дължина на вълната от 490 nm (пероксидаза) или 405 nm (алкална фосфатаза). OPD субстрат: положителен резултат - оранжево-кафяво оцветяване. Субстрат 5-аминосалицилова киселина: положителен резултат - интензивно кафяво оцветяване.
за положителен резултатвземете излишъка от оптичната плътност на тестовите проби над контролата пет до шест пъти.
Откриването на антитела(в серум) се основава на същия принцип, но твърдофазният носител се сенсибилизира с известен антиген, третира се с тестовия серум, след това с ензимно белязан антивидов имуноглобулин. Въвежда се субстрат и по цветната реакция се преценява наличието или отсъствието на антитела в изследвания кръвен серум.
ЗАДАЧИ ЗА САМОСТОЯТЕЛНА РАБОТА
1. Да се идентифицират култури от патогени на бруцелоза и салмонелоза чрез директен MFA.
2. Идентифицирайте културата на Salmonella с двустепенна MFA.
3. Да се изследва микроскопската картина, като се вземат предвид резултатите от хистохимичния ELISA (тест за имунна пероксидаза).
1. Каква е същността на едностепенната, двустепенната и тристепенната МФА?