Метод за оцветяване на кръвни натривки

Собственици на патент RU 2304776:

Изобретението се отнася до ветеринарната медицина и медицината, по-специално до методи за оцветяване на кръвни натривки. Същността на метода за оцветяване на кръвни натривки е, че за приготвяне на кръвни натривки те се фиксират с разтвор на Никифоров, оцветяването се извършва с две багрила, които се приемат като хематоксилин на Ерлих и еозин-натрий, първо натривките се поставят в разтвор на хематоксилин на Ерлих, стареят в запечатан контейнер за 360 дни за 2-3 минути, след което се потапят. се поставят в съд с чешмяна вода за 1-2 минути, докато петната посиняват, след това петната се изсушават с филтърна хартия и се поставят в 1% воден разтвор на еозин-натрий за 1-2 минути, оцветените петна се промиват с дестилирана вода за 8-10 секунди и се изсушават на въздух. Използването на метода дава възможност за получаване на петна с високо качество на оцветяване, като същевременно се намалява времето за оцветяване и с възможност за многократно използване на работни разтвори за багрило.

Областта на технологията, към която принадлежи изобретението.

Изобретението се отнася до ветеринарната медицина и медицината, по-специално до методи за оцветяване на кръвни натривки, и може да се препоръча за използване при хематологични изследвания, както и при диагностика на кръвни паразитни заболявания.

Известен метод за оцветяване на кръвни натривки по Romanovsky-Giemsa, който се състои в еднократно поставяне на кръвни натривки в разтвор на багрило, последвано от измиване с дестилирана вода и изсушаване на открито (Merkulov G.A. Курс на патологична хистологична технология. Ленинград: Medgiz, 1961, стр. 188-189; 191-192).

Недостатъците на този метод:

- необходима е прясно приготвена дестилирана вода;

- работният разтвор на багрилото бързо се разваля и не може да се използва повторно.оцветяване;

- качеството и скоростта на оцветяване значително зависят от температурата на околната среда (колкото по-ниска е температурата, толкова по-дълго е оцветяването);

- времето за оцветяване е средно 30-60 минути, а при някои лабораторни изследвания такова забавяне е неприемливо.

Известен метод за оцветяване на кръвни натривки според Leishman, който се състои в нанасяне на боя на Leishman върху нефиксирана намазка, с допълнително изливане на дестилирана вода върху намазката, измиване на намазката под чешмяна вода и изсушаване на открито (Sapozhnikov A.G., Dorosevich A.E. Хистологична и микроскопска техника. Смоленск: SAU, 2000, стр. 190-191).

Недостатъците на този метод:

- разтворът на багрилото се нанася върху нефиксирана петна, което може да причини лошо качество на петна;

- необходима е прясно приготвена дестилирана вода;

- дестилирана вода се смесва с багрилото директно върху самото намазка, което създава известни трудности при оцветяването.

Все пак трябва да се отбележи, че този метод за оцветяване на кръвни петна има следните недостатъци:

- предполага наличието на прясно приготвена дестилирана вода (ако водата не е прясно приготвена, боята, когато се разрежда с такава вода, се утаява под формата на флокулентна утайка, което прави разтвора неподходящ за по-нататъшна употреба и това е свързано с материални загуби);

- когато температурата на околната среда спадне, времето за оцветяване се увеличава от 30 на 60 минути, а при провеждане на някои лабораторни изследвания такова забавяне е неприемливо;

- работният разтвор на багрилото се приготвя всеки път наново, което води до разход на време и материални ресурси.

Целта на изобретението е разработването на бързо и висококачествено производство на големи и малки партиди качествено оцветени кръвни натривки при провеждане на хематологични изследвания в медицинската и ветеринарна лабораторна практика.

Техническият резултат, който може да бъде получен с помощта на предложеното изобретение, е да се получат висококачествени и сравнително бързо оцветени кръвни натривки в лабораторията, което ще позволи на служителите на ветеринарните и медицинските лаборатории да спестят време и материални ресурси, тъй като работните разтвори на предложените багрила се съхраняват и не се влошават дълго време (до една година) и могат да се използват многократно.

Техническият резултат се постига с помощта на метод за оцветяване на кръвни натривки, включващ приготвяне на кръвни натривки, тяхното фиксиране с разтвор на Никифоров, сушене на въздух и последващо оцветяване. Оцветяването се извършва с две багрила, които се приемат като хематоксилин на Ерлих и еозин-натрий, докато работният разтвор на хематоксилин на Ерлих се съхранява в запечатан контейнер в продължение на 360 дни, след което се извършва оцветяване и петната първо се поставят в разтвор на хематоксилин на Ерлих за 2-3 минути, след което петната се потапят в съд с чешмяна вода, времето на експозиция, при което е 1-2 минути, докато петната посиняват, след това в 1% - еозин-натриев воден разтвор за 1-2 минути, промиват се с дестилирана вода за 8-10 секунди и се изсушават на въздух.

Същността на метода за оцветяване на кръвни петна е следната. Първо се приготвят намазки от периферна кръв. Времето за оцветяване е 5-7 минути. Приготвените намазки се фиксират с разтвор на Никифоров (спирт-етер в съотношение 1:1) по общоприетия метод. След това се поставят петнав стъклен съд с работен разтвор на хематоксилин на Ehrlich 360-дневна експозиция (ако броят на намазките не надвишава 10, тогава багрилото може да се накапва) за 2-3 минути при стайна температура (+25-27 ° C). След отстраняване на намазките от багрилния разтвор, те се поставят в съд с чешмяна вода за 1-2 минути (докато намазките посиняват). След това петната се изваждат от съда с чешмяна вода и след изсушаване с филтърна хартия се поставят в контейнер с 1% воден разтвор на еозин-натрий за 1-2 минути. След отстраняване на намазките от разтвора на еозина, те се промиват с дестилирана вода за 8-10 секунди и се изсушават на въздух.

Примери за конкретно изпълнение на предложения метод за оцветяване на кръвни натривки.

За целите на оцветяването са взети 2 партиди натривки, по 30 натривки във всяка партида. Първата партида беше оцветена по метода на Романовски-Гимза и служи като контрола. Втората партида цитонамазки се оцветява както следва. Кръвните петна се подготвят за оцветяване по приетия метод (Позов С.А., Багамаев Б.М. Лабораторни методи за изследване на кръв и урина (указания), Ставропол, 1996 г., стр. 12-14). Взети са 2 багрила: 1% разтвор на еозин в дестилирана вода и хематоксилин на Ерлих, който включва хематоксилин (2,0 ml), абсолютен алкохол (100 cc), глицерин (100 cc), дестилирана вода (100 cc) и ледена оцетна киселина (10 cc). Боята е приготвена по общоприетия метод (Меркулов Г.А. Курс на патологични и хистологични техники. Ленинград: Медгиз., 1961, стр. 98). Приготвеният багрилен разтвор съгласно процедурата се поставя в чист стъклен съд, херметически затворен и инкубиран в продължение на два месеца. Натривките първо се поставят в хематоксилин за 10 минути, след което се измиват с чешмяна вода.(10 секунди) и се поставя в съд с чешмяна вода до посиняване (1 минута). След това петната се поставят в разтвор на еозин за 3 минути, след което се промиват с дестилирана вода и се изсушават на въздух.

Анализът на получените данни показа, че първата група петна е оцветена задоволително, от 30 слайда са отхвърлени 9. По време на оцветяването имаше някои трудности, тъй като беше необходимо постоянно да се следи температурата на околната среда и да се сравняват получените данни с времето на оцветяване. Намазките, оцветени по предложения метод, са неподходящи за изследване поради недостатъчно оцветяване на ядра и включвания.

Партида от стъкла (30 броя) се оцветява аналогично на пример 1 (съгласно предложения метод), но времето на експозиция в хематоксилин се увеличава до 20 минути.

Анализът на получените данни показа, че увеличаването на експозицията на хематоксилин позволява да се получат нормално оцветени ядра и клетъчни включвания, но цитоплазмата се оказа преоцветена с еозин. Някои от получените цитонамазки обаче подлежаха на оценка.

Следващата партида натривки (30 бр.) се оцветяват подобно на примери 1, 2, но натривките се държат в еозин за 2 минути (1 минута по-малко, отколкото в предишния случай).

Анализът на получените данни показа, че намазките, оцветени по този метод, са по-добри по качество от намазките, получени в предишни случаи, но времето за оцветяване е 25 минути, което се различава леко от времето на оцветяване на кръвни натривки по Romanovsky-Giemsa.

Партида от кръвни натривки в количество от 30 чаши се оцветява аналогично на примери 1, 2, 3, но в този случай се използва хематоксилин, съхраняван в запечатан стъклен съд за 360 дни. Времето за оцветяване в хематоксилин е 5 минути, а в еозин - 2 минути. Намазките се оказахапребоядисани.

Анализът на получените данни ни позволи да заключим, че по-старият разтвор на хематоксилин оцветява кръвните намазки по-бързо и по-интензивно.

Тази партида от кръвни натривки (30 чаши) се оцветява аналогично на примери 1, 2, 3, 4. Времето на престой на натривките в хематоксилин за 360-дневна експозиция е 2 минути; в еозин - 2 минути.

Анализът на получените данни ни позволи да заключим, че предложеният метод за оцветяване на кръвни натривки е по-добър от най-често използвания (според Romanovsky-Giemsa) и дава възможност за получаване на качествено оцветени кръвни натривки за по-кратко време (7-10 минути) в зависимост от времето на експозиция на разтвора на хематоксилин.

Използването на предложения метод за поетапно оцветяване на кръвни натривки в хематоксилин и еозин в медицинската и ветеринарна практика на лабораторни изследвания дава възможност за получаване на висококачествени оцветени натривки за по-кратко време с възможност за многократно използване на багрила.

Настоящото изобретение в сравнение с прототипа и други известни технически решения има следните предимства:

- намалява времето за оцветяване;

- ви позволява да получите петна с висококачествено оцветяване;

- дава възможност за многократна употреба на работни разтвори на багрила;

- не изисква специално лабораторно оборудване;

- позволява на служителите на ветеринарните и медицинските лаборатории да спестят време и материални ресурси.

Метод за оцветяване на кръвни натривки, включващ приготвяне на кръвни натривки, фиксирането им с разтвор на Никифоров (алкохол-етер в съотношение 1:1), оцветяване с багрило, включващо еозин, измиване на оцветени натривки с дестилирана вода и изсушаване на въздух, характеризиращ се с това, че оцветяването се извършва с две багрила,като се вземат хематоксилин на Ерлих и еозин-натрий, първо натривките се поставят в разтвор на хематоксилин на Ерлих, отлежал 360 дни в запечатан съд за 2-3 минути, след което се потапят в съд с чешмяна вода за 1-2 минути до посиняване на натривките, след което натривките се изсушават с филтърна хартия и се поставят в 1% воден разтвор на еозин. -натрий за 1-2 минути, след което се промиват с дестилирана вода за 8-10 s и се подсушават.

---