Метод за определяне на патогенността на микроорганизми, Патентна банка
Изобретението се отнася до областта на медицината и се отнася до метод за определяне патогенността на микроорганизма Staphylococcus epidermidis. Същността на изобретението се състои в инкубирането на експериментални проби. Изолиран от донори с лактоферин в концентрация 320-580 ng / ml с по-нататъшно определяне на броя на оцелелите микроорганизми в сравнение с контролата. Предимството на изобретението е повишаване на чувствителността на метода. 1 табл.
Изобретението се отнася до медицината, а именно до клиничната лабораторна диагностика, и може да се използва по-специално за определяне на етиологичната роля на микроорганизмите в инфекциозната патология.
В практическата медицина има няколко начина за определяне на патогенността на изолирани микроорганизми. По-специално, определянето на такива фактори на патогенност като адхезивна активност на бактерии, цитолитична и хемолитична активност, тяхното производство на протеаза, хиалуронидаза, както и разграждането от бактерии на такива фактори на неспецифична резистентност на организма като лизозим, комплемент и интерферон (Наръчник за микробиологични и вирусологични методи за изследване / Под редакцията на М. О. Биргер - 3-то издание, преработено и допълнено - М .: Медицина, 1982, стр. 117; Щайние Р., Еделберг Е., Инграм Дж. Светът на микробите - Т. 3. - М.: Мир, 1979, стр. 365-397).
Патогенността се отнася до способността на бактериите да причиняват заболяване. Това е видов полидетерминантен признак на патогена, показващ неговата способност да предизвика инфекциозен процес, тоест да проникне в тялото, да се размножава в него и да има увреждащ ефект върху него. Основните фактори на патогенност се разделят на три групи:
1. Фактори, определящи взаимодействието на микроорганизма с епителалигавици.
2. Фактори, допринасящи за устойчивостта на микроорганизма към хуморални и клетъчни фактори на защита на макроорганизма и способността да се размножава in vivo.
3. Способността да произвежда токсини и токсични продукти, причинявайки действителния патологичен процес.
Важна фаза на инфекциозния процес е взаимодействието на микроба с клетъчните и хуморалните механизми на гостоприемника и осигуряването на възпроизвеждане in vivo. Патогенните и опортюнистични бактерии използват различни защитни механизми за това. Така камшичетата на подвижните бактерии предотвратяват контакта им с фагоцитите. Бактериите могат да произведат фактори, които инхибират миграцията на левкоцитите към мястото на инфекцията или инхибират бактериалното усвояване. Много бактерии имат структури, които осигуряват тяхното оцеляване и възпроизвеждане във фагоцитите. Тези структури допринасят за устойчивостта на микроорганизма към храносмилателната активност на фаголизозомите или предотвратяват сливането на фагозомите с лизозомите. В същото време резистентността към бактерицидното действие на нормалния серум в Klebsiella, например, се дължи на наличието на външни мембранни протеини на липополизахариди и киселинни полизахариди на К-антигена. Също така факторите на патогенност включват адхезивни и цитотоксични свойства на бактериите (пили, екзо- и ендотоксини, ензимни фактори).
Този метод има следните недостатъци.
Методът не позволява да се направи достатъчно надеждно заключение за потенциалната патогенност на даден щам, тъй като ако лизозимът е един от основните антимикробни агенти в слюнчената и слъзната течност, тогава в други среди на човешкото тяло концентрацията му е значително по-ниска и наличието на това свойство в микроорганизма все още не осигурява на неговия носител достатъчна резистентност и способност да причини инфекциозно заболяване.процес. В допълнение, колебанията в нивото му по време на развитието на определени нозологични форми практически не са проучени. Напротив, повишаването на нивото на лактоферин в организма по време на сепсис, пневмония и други инфекциозни заболявания е установен факт и следователно устойчивостта на микроорганизма към този фактор на неспецифичен имунитет ще му позволи да се размножава успешно in vivo.
Методът изисква използването на тест култура от Micrococcus lysodeicticus за количествено определяне на антилизозимната активност и в резултат на това допълнителни манипулации и реагенти за нейното приготвяне.
Методът се основава на метода на забавения антагонизъм и следователно удължава времето за анализ с допълнителни 24 часа за предварително отглеждане на тестовата култура.
Целта на настоящото изобретение е да се повиши чувствителността, точността, да се намали времето, необходимо за установяване на патогенността на изолирания щам, като същевременно се увеличи простотата и достъпността на предложения метод за широко практическо приложение.
Целта на изобретението се постига чрез използване на лактоферин като маркер, взет в концентрация 320 - 580 ng/ml, с последващо определяне на броя на оцелелите микроорганизми чрез сравняване на оптичната плътност на експеримента и контролата.
По този начин предимството на предложения метод е, че установяването на увреждащите ефекти на лактоферина върху изолирани микроорганизми повишава надеждността на определяне на тяхната патогенност. Тъй като се определя прякото увреждащо действие на лактоферина върху бактериалната клетка, времето за анализ след получаване на чиста култура е 3,5 часа, което е с 44 часа по-бързо от прототипа.
В допълнение, използването за количествено определяне на броя на оцелелите бактериални клеткислед инкубиране с лактоферин на фотоелектрокалориметър (KFK-2) прави предложения метод по-чувствителен, което води до по-висока точност и възпроизводимост на резултатите.
Методът е достъпен за широко практическо приложение поради относително ниската цена и лекотата на изпълнение.
Предложеният метод беше успешно тестван на 100 проби в практическата работа на Катедрата по обща и биоорганична химия на Астраханската държавна медицинска академия през 2002 г.
По-долу са резултатите от теста.
Установена е устойчивостта към увреждащото действие на Staphylococcus epidermidis lactoferrin, който има типични биохимични, морфологични и културни характеристики и е изолиран от сперматозоидите на здрав донор на S-va.
В една епруветка се поставят 0,2 ml лактоферин, взет в концентрация 0,8 μg/ml (опит), а във втората - 0,2 ml 0,5% разтвор на натриев хлорид - контрола. След това към контролната и опитната епруветки се добавят 0,1 ml суспензия от изследваната култура с концентрация 10 20 µm/ml. Крайната концентрация на LF в експеримента е 320 ng/ml.
В този вариант ОП на експеримента е 70% по-нисък от контролния (т.е. беше 30%). Въз основа на получените резултати се заключава, че няма патогенен потенциал в този щам на Staphylococcus epidermidis (Таблица 1).
Установена е устойчивостта към увреждащото действие на Staphylococcus epidermidis lactoferrin, който има типични биохимични, морфологични и културни характеристики и е изолиран от спермата на пациент G-ko с хроничен простатит.
В една епруветка се поставят 0,2 ml лактоферин, взет в концентрация 0,8 μg/ml (опит), а във втората - 0,2 ml 0,5% разтвор на натриев хлорид - контрола. След това към контролната и експерименталната епруветки се добавят по 0,3 ml.суспензии от изследваната култура в концентрация 10 20 микрона/мл. Крайната концентрация на Lf в експеримента е 400 ng/ml.
Освен това изследването се провежда по начина, описан в пример №1.
В този пример OD на опита надвишава контролата с 40% (т.е. беше 140%). Въз основа на получените резултати се прави заключение за патогенността на този щам на Staphylococcus epidermidis и значението му в етиологията на простатита (Таблица 1).
Установена е устойчивостта към увреждащото действие на Staphylococcus epidermidis lactoferrin, който има типични биохимични, морфологични и културни характеристики и е изолиран от раневия секрет на пациент H-a.
В една епруветка се поставят 0,2 ml лактоферин, взет в концентрация 0,8 μg/ml (опит), а във втората - 0,2 ml 0,5% разтвор на натриев хлорид - контрола. След това към контролната и опитната епруветки се добавят 0,4 ml суспензия от изследваната култура с концентрация 10 20 μm/ml. Крайната концентрация на Lf в експеримента е 580 ng/ml.
Освен това изследването се провежда по начина, описан в пример №1.
В този случай OD на експеримента надвишава контролата с 20% (т.е. беше 120%). Въз основа на получените резултати се прави заключение за патогенността на този щам на Staphylococcus epidermidis и значението му в етиологията на раневата инфекция (Таблица 1).
Предложеният метод постига положителен ефект: повишава ефективността на определяне на патогенността на микроорганизмите чрез използване на тяхната резистентност към лактоферин като маркер, повишава чувствителността, точността на анализа при използване на евтино оборудване и реактиви, простота и достъпност за широка практическа употреба, намалява броя на етапите в сравнение с прототипа и в резултат на това намалява времето,необходими за издаване на лабораторно заключение за 44 часа.
Провеждането на това изследване ще разшири възможностите за установяване на етиологията на инфекциозния процес с различна локализация.
Предложеният метод може да се използва във фундаменталната и практическата медицина за определяне на патогенността на микроорганизмите.
| Таблица 1 Възпроизводимост на резултатите от определяне на патогенността на микроорганизмите по предложения метод | |||||
| Пример | Концентрация на лактоферин, ng/ml | OP контрол | ОП опит | %ОП опит от контрола | Патогенност на изолирани микроорганизми |
| 1 | 320,0 | 0,05 | 0,015 | 30,0 | Не е патогенен |
| 2 | 400,0 | 0,1 | 0,120 | 120,0 | Патогенен |
| 3 | 580.0 | 0,2 | 0,280 | 140,0 | Патогенен |
Иск
1. Метод за определяне на патогенността на микроорганизми Staphylococcus epidermidis, характеризиращ се с това, че експериментални проби от микроорганизми, изолирани от донори, се инкубират с лактоферин в концентрация 320-580 ng/ml с по-нататъшно определяне на броя на оцелелите микроорганизми чрез сравняване на оптичната плътност на експеримента и контролата и ако оптичната плътност надвишава тази на контролата, този щам се счита за патогенен.
MM4A Предсрочно прекратяване на български патент за изобретение поради неплащане на таксата за поддържане в определения срок