Методи за изследване на клетките

Традиционни методи на клетъчна биофизика. Методи на електронна микроскопия и флуоресцентни сонди за регистриране на промени в много клетъчни процеси. Възстановена флуоресценция след фотоизбелване. Конфокална лазерна сканираща микроскопия.

микроскопия

Изпратете добрата си работа в базата знания е лесно. Използвайте формата по-долу

Студенти, докторанти, млади учени, които използват базата от знания в обучението и работата си, ще ви бъдат много благодарни.

"Методи за изследване на клетките"

    1. Метод на електронна микроскопия
  • 2. Метод на флуоресцентна сонда
  • 3. Метод за възстановена флуоресценция след фотоизбелване
  • 4. Метод на конфокална лазерна сканираща микроскопия
  • 5. Метод на раманова спектроскопия
  • 6. Раманова микроспектроскопия
  • 7. Метод на динамична фазова микроскопия

1. Метод на електронна микроскопия

1. Смолата съдържа редица специални съставки. След изливането срезовете се поставят в термостат и се инкубират при температура 37 "C в продължение на 12 часа. След отстраняване на ацетона препаратът се излива със смола и се инкубира последователно при температура от 37 до 57 ° C. След това препаратите се нарязват на микротом (срезове с дебелина 60-90 nm), гледат се и се снимат в електронен микроскоп ELM-100A.

2. Метод на флуоресцентна сонда

Методът за флуоресцентно определяне на мембранно свързан калций се основава на способността на антибиотика CTC, локализиран в мембраната, да образува комплекс с калциев йон, което води до увеличаване на квантовия добив на флуоресценция на сондата. Светенето му е записано от същияклетъчна площ през цялото време на експеримента с помощта на флуоресцентен микроскоп. Възбуждането на CTC флуоресценцията се индуцира с помощта на халогенна лампа с нажежаема жичка, подчертаваща лентата чрез комбинация от филтри. Регистрирането на блясъка се извършва с помощта на фотометрична приставка, подчертаваща лентата с помощта на интерферентни филтри при дължина на вълната на максимално предаване на светлинния лъч от 490 и 550 nm.

При регистриране на вътреклетъчно pH като сонда се използва PDA при крайна концентрация 10 - 5 mol. След 20 минути инкубация (времето, необходимо за натрупване в обекта на достатъчно количество флуоресценция за флуориметрия), клетките се измиват старателно от извънклетъчния PDA. За да се осигури постоянно рН на извънклетъчната среда по време на клетъчната инкубация, се добавят 50 mmol HEPES, довеждайки рН на разтвора до 6,2 - 8,5. Флуоресцентните спектри на препаратите се записват с помощта на обърнат микроспектрофлуориметър: флуоресцентното възбуждане на препаратите обикновено се извършва с помощта на халогенна лампа с нажежаема жичка и комбинация от стъклени филтри. Размерът на фотометрираната площ на клетката е като правило 60 h 60 μm (с леща h 10). Стойността на вътреклетъчното рН се определя от съотношението на интензитетите на флуоресценция на оцветения препарат при дължини на вълните 516 и 570 nm, сравнявайки го със стойностите на съответната калибровъчна крива, което е зависимостта на това съотношение от стойностите на рН на флуоресцеинови буферни разтвори.

За да се регистрира вътреклетъчен Ca 2+ след зареждане и преди началото на експеримента, клетките се промиват с първоначалния разтвор и се инкубират в продължение на 30-40 минути за деестерификация и постигане на равновесно разпределение между свързаните и свободните форми на молекулите на пробата (fura-2) вътре в клетката. Да се ​​определи съдържанието на калций в клеткатаИзползва се микроспектрофлуориметричен метод. Клетките се поставят в перфузирана клетка върху предметния стол на обърнат микроскоп, комбиниран със спектрофлуориметър, оборудван с ксенонова лампа, разделител на лъчи, два монохроматора и механизъм с двоен огледален чопър, който позволява редуване на възбуждането на молекули фура-2 чрез лъчи с две дължини на вълната - 340 и 380 nm (с честота 100 Hz). Ширината на лентата на възбуждане не трябва да надвишава 3,5 nm. Концентрацията на Ca 2+ се изчислява от съотношението на интензитетите на флуоресценция (505 nm) в отговор на възбуждане, причинено от лъчи с дължини на вълните 340 и 380 nm.

3. Метод за възстановяване на флуоресценцията след фотоизбелване

Опростена схема на инсталацията за изследване на възстановената флуоресценция след фотоизбелване: 1 - лазер; 2,3 - атенюатори (атенюатори на лъча); 4 - диафрагма; 5 - осветител; 6 - микроскоп кондензатор; 7 - изследвана клетка; 8 - обектив на микроскопа; 9 - дихроично огледало, отразяващо падаща светлина и предаващо светлина на възбудена флуоресценция; 10 - прекъсващ светлинен филтър; 11 - "сонда" - тесен отвор, който излъчва флуоресценция от изследваната област; 12 - PMT; 13 - блок за регистрация и контрол на инсталацията

Методът на възстановена флуоресценция след фотоизбелване се използва в клетъчната биофизика за измерване на коефициента на латерална дифузия на протеини и липиди в плазмените мембрани. Ако маркираме протеини или фосфолипиди, които ни интересуват, с флуоресцентен етикет, например производно на флуоресцеин, и ги въведем в клетка, тогава флуоресценцията се наблюдава по време на регистрация с флуоресцентен микроскоп, чиято стойност може да бъде оценена с фотоумножителна тръба и анализирана на персонален компютър.

Лазерният лъч, който възбужда флуоресценцията, се фокусирана мястото на плазмената мембрана (от порядъка на няколко квадратни микрона). Освен това този лъч трябва да бъде отслабен от атенюатори до такава степен, че да предизвика само флуоресценция на етикета, но не и фотоокисление на компонентите на мембраната.

Възстановяване на интензитета на флуоресценция след фотоизбелване. Методът за изчисляване на данни за три точки: 7 (R -1), които се дължат на вибрации в равнината на C-C и C-N връзки и деформационни вибрации на C-H. Някои от тях се влияят от химични трансформации, протичащи с железния атом, и могат да се използват за изследване на структурата на макроцикъла.

При изследване на състоянието на хемоглобина в еритроцитите чрез раманова спектроскопия кръвната проба обикновено се поставя в специален държач, който позволява фокусирането на лъча вълнуваща светлина върху обекта. Източникът на вълнуваща светлина при регистрирането на рамановия спектър е газов лазер, който непрекъснато генерира радиация в областта на следните дължини на вълната: 441,6; 476.5; 488.0; 496.5; 501.7; 514,5 nm. С помощта на светлинни филтри мощността на излъчване се поддържа на ниво от 20 - 100 mW, което не води до съществени промени в естественото състояние на обекта. Радиацията, разпръсната върху пробата, се събира от система от лещи на входния процеп на монохроматора. Рамановият спектър се сканира с двоен монохроматор, спектралната област на устройството е 400 - 850 nm, относителната апертура е 1: 5,3, обратната дисперсия е 0,45 nm/mm, полуширината на инструменталната функция е не повече от 1 cm -1 (при дължина на вълната 550 nm), скоростта на сканиране е 0,18 nm/s. , точността на измерване е около 4 cm -1. Регистрацията на RRR сигналите се извършва от PMT, работещ в режим на броене на фотони. Натрупването на спектри се извършва на многоканален импулсен анализатор или персонален компютър.

Раманов спектър на хемоглобин порфирин

Блокова схема на раманов спектрометър

6. Раманова микроспектроскопия

7. Метод на динамична фазова микроскопия

Блокова схема на динамичен фазов микроскоп

Подобни документи

Дефиниране на предназначението и описание на механизма на хистохимичните методи за идентифициране на химикали в хистологични срезове. Описание на електронна, луминесцентна и ултравиолетова микроскопия. Радиавтография и култура на клетки и тъкани извън тялото.

Методи на светлинна микроскопия, тъмно поле, фазов контраст, наблюдение в инфрачервени и ултравиолетови лъчи, в светлината на луминесценция. Поляризация, електронна микроскопия. Електронна микроскопия на Лоренц. Същността на зоналното центрофугиране.

Основният предмет на изучаване на хистологията. Основните етапи на хистологичния анализ, обектите на неговото изследване. Процесът на производство на хистологичен препарат за светлинна и електронна микроскопия. Флуоресцентна (луминесцентна) микроскопия, същността на метода.

Характеристика на етапите на развитие и възможностите на флуоресцентната микроскопия. Методи за разкриване на физиологичното състояние на клетките на микроводораслите. Количествена регистрация на интензитета на флуоресценция. Определяне съдържанието на витамини в растителните клетки.

Методи за изследване на морфологията на микроорганизмите. Правила за работа в микробиологичната лаборатория. Микроскопия в светло поле. Монтаж на осветление по Кьолер. Изображения на фиксирани препарати, получени в резултат на изследване на метода за изследване на морфологията.

Характеристики на структурата и растежа на растителните клетки. Методи за изследване на растителни клетки. Електронна микроскопия, възможности на светлинния микроскоп. Метод на замразяване.Диференциално центрофугиране, фракциониране. Метод на клетъчна култура.

Методи за изследване на морфологията на микроорганизмите при микроскопиране на препарати, получени от чисти култури чрез оцветяване. Начини за жизненоважно оцветяване на микроорганизми, за да се избегнат артефакти в резултат на токсичния ефект на багрилото.

Позиции на клетъчната теория. Характеристики на електронната микроскопия. Подробно описание на структурата и функцията на клетките, техните връзки и взаимоотношения в органите и тъканите на многоклетъчните организми. Гравитационна хипотеза от Робърт Хук. Същността на устройството на еукариотната клетка.

Разглеждане на възможностите за светлинна флуоресценция и интерферентна микроскопия. Използване на ядрено-магнитен резонанс и вътреклетъчни електроди за определяне на химичните условия в клетките. Технологии за разцепване на ДНК чрез ограничаване на нуклеазите.

Функции на биологичните мембрани и техните компоненти. Спектроскопски методи за измерване на скоростта на въртене на липидите и протеините вътре в мембраната и скоростта на страничната дифузия на тези компоненти в равнината на мембраната. Използване на спинови или флуоресцентни сонди.