Рестрикционни ензими
Пробив в развитието намолекулярното клониранебеше откритието в началото на 1970 г. на бактериални ендонуклеази (рестриктазни ензими) - ензими, които разпознават специфични последователности в двойната спирала на ДНК и разцепват двете нишки на ДНК на мястото (мястото) на разпознаване. Скъсванията могат да бъдат директно противоположни едно на друго, в който случай те оставят цели вериги на ДНК или могат да бъдат изместени от няколко базови двойки във всяка посока, което води до единия край на ДНК веригата, който "виси" над другия.
Понастоящемtimeса известни над 3500 рестрикционни ензима, всеки със собствено място за разпознаване от четири или шест базови двойки, въпреки че няколко ензима имат по-дълги места. Базовата последователност на сайта обикновено е палиндром, т.е. съвпада при четене от 5' и 3' края на ДНК веригата.
Например,рестриктазният ензимEcoRI разпознава специфичната палиндромна последователност от шест двойки бази 5'-GAATTC-3, където и да се намират те в двойната ДНК молекула.
Ензимът разцепва ДНКна това място, измествайки разкъсванията на ДНК вериги с 4 базови двойки между гуанин и съседен аденин в GAATTC последователността. Това произвежда два фрагмента, всеки с едноверижен край от четири 5'-AATT-3' бази в края.
Разцепването наДНКмолекула от специфичен рестрикционен ензим разгражда ДНК на характерен и възпроизводим набор от фрагменти, чието разпределение по дължина отразява честотата и позициите на специфичните места на действие на ензима. Например, рестрикционният ензим EcoRI разкъсва двойната спирала на ДНК специално при последователността 5'-GAATTC-3'.
Обработката наДНКна целия човешки геном с EcoRI генерира набор от приблизително 1 милионфрагменти с променлива дължина, всеки със специфична позиция в генома. Средно ензим с сайт за разпознаване от 6 базови двойки, като EcoRI, трябва да разцепва човешка ДНК на всеки 46 базови двойки или на всеки 4096 базови двойки. В действителност такива сайтове не са равномерно разпределени поради състава на базите и тяхната последователност в целия геном.
Така,EcoRIфрагментира ДНК на парчета, вариращи по размер от десетки до много стотици хиляди базови двойки; дължината на всеки фрагмент се определя от това колко ДНК има между две последователни места за разпознаване на EcoRI.
Тъй като всички третирани с EcoRIДНКмолекули, независимо от техния произход, имат идентични едноверижни краища, всеки две третирани с EcoRI ДНК молекули могат да бъдат сплайсирани заедно in vitro чрез сдвояване на комплементарни краища на 4 базови двойки с ензима ДНК лигаза. Това създава рекомбинантна ДНК молекула с един край, идващ от един източник, а другият край от друг.
Когато рестрикционен ензим прерязва и двете вериги в една и същапозиция, оставяйки "тъпите" краища, ДНК лигазата може също да ги свърже заедно без необходимост от съвместимост на надвиснала нишка.