Столон култура и регулиране на растежа и туберкулозата на растенията при картофи in vitro (

Като ръкопис

Назарова Нигора Нурахмадовна

Столон култура и регулиране на растежа и туберкулозата на растенията при картофиин витро

(03.00.12–физиология и биохимия на растенията)

Резюме

дисертации за научна степен

Доктор по биология

Душанбе-2006

Работата е извършена в Института по физиология на растенията и генетика на Академията на науките на Република Таджикистан

Научен ръководител: чл.-кор

Академия на науките на Република Таджикистан,

Доктор на биологичните науки, професор К.А. Алиев

Официални опоненти: доктор на биологичните науки, проф. Бободжанов В.А.,

член-кореспондент Академия на науките на Република Таджикистан, доктор на селскостопанските науки, Фелалиев А.С.

Водеща организация: Таджикски аграрен университет

Защитата ще се състои на "__" ________ 2006г. в ___ часа на заседание на дисертационния съвет D047.001.01 в Института по физиология на растенията и генетика на Академията на науките на Република Таджикистан (734063, Душанбе, ул. Айни, 299/2).

Дисертацията се намира в Централна научна библиотека. Академия на науките на Индира Ганди на Република Таджикистан.

Резюмето е изпратено на "__" __________ 2006 г

Доктор на биологичните науки Джумаев Б.Б.

ВЪВЕДЕНИЕ

Уместност на работата. Напредъкът в областта на съвременните растителни биотехнологии е пряко свързан с разработването на методологични техники за култивиране на клетки in vitro. По този метод са получени редица сомаклонални линии, форми и сортове растения с ценни стопански качества, които се използват в много страни по света.

От друга страна, човешката общност има остра нужда от нови знания и технологии, за да увеличи производството.храна, подобряване на общественото здраве и защита на околната среда. Биотехнологиите имат голям принос за решаването на тези проблеми. Следователно прилагането на биотехнологични методи в Република Таджикистан е един от най-важните фактори за увеличаване на добивите на културите и следователно на икономическия потенциал.

С помощта на методите на генното и клетъчното инженерство са получени редица линии, форми на култивирани растения (картофи, соя, царевица и др.), които имат признаци на устойчивост към вируси, патогени и пластичност към стресовите фактори на околната среда. Поради това се съкращават сроковете за получаване на нови сортове с икономически полезни качества и получаване на семенен материал, свободен от вируси и патогени, което има големи перспективи за Република Таджикистан.

От теоретична гледна точка е интересно да се проучи степента на ДНК сортова променливост, открита чрез полимеразна верижна реакция (PCR) и физиологични процеси в in vitro култура, за да се разработят методи за микроразмножаване и микротуберизация на картофи.

Зависимостта на туберкулозата от действието на фактори като светлинен режим (фитохром), хормонален статус, въглехидратен метаболизъм и др. показани в редица трудове (Чайлахян, 1984; 1988; Аксенова и др., 2002; Кузнецов и Кулаева, 2004).

В същото време остава отворен въпросът за специфичните пътища на действие на фитохормоните и въглехидратите и тяхното взаимодействие в процеса на иницииране на туберкулозата, тъй като наличните резултати не винаги могат да бъдат интерпретирани еднозначно (Hussey and Stacey, 1995; Davies, 1984).

По този начин, за прехода на регенеранти към туберизация in vitro е необходимо наличието на висока концентрация на захароза (5-10%), но има доказателства, че захарозата има малък ефект върху инициирането.туберкулизация. Има също много несигурност по отношение на ролята на фитохормоните в започването на клубените. По този начин е доказано, че гиберелините насърчават растежа на столони, но инхибират образуването на грудки (Simko, 1994; Eving, 1995; Xin Xu et. al., 1998).

През последните години много са използвали нов подход за регулиране на туберкулозата на картофите in vitro. По този начин се използват по-специално генетично трансформирани картофени регенеранти с променен хормонален статус, като трансформанти, носещи roLB и roLC гените на Agrobacterium Rhizogenes (Aksenova et al., 2002).

Би било важно да се проучи възможността за използване на картофени столони в хормоналната и въглехидратната регулация на генната експресия, инициирането и растежа на клубените в in vitro система. Такова изследване все още не е провеждано при създаване на система, свободна от вируси и патогени на картофени клубени, използвайки биотехнологични методи.

Ние вярваме, че изследването на процесите на иницииране и растеж на грудки in vitro с помощта на столонна култура ще позволи да се изясни ролята на въглехидратите и хормоните в инициирането на растежа на клубените и да се приложат възможностите на биотехнологичните методи за клоново размножаване на картофи.

Целта и задачите на работата. Целта на тази работа е да се проучат особеностите на отглеждането на изолирани столони, възможността за тяхното използване при микроразмножаване и регулирането на туберкулозата в генотипите на картофите. В съответствие с това се поставят следните задачи:

  • разработване на условия за отглеждане на изолирани картофени столони;
  • изследване на процесите на растеж в регенеранти, получени от изолирани столони;
  • изследване на процесите на образуване на микроклубени в зависимост от условията на фотопериода;
  • сравнителен анализ на етапите на туберкулоза при картофите в зависимост отефекти на въглехидратите в in vitro култура.

Научна новост на работата.

  • При изследване на растежа и размножаването на картофени регенеранти in vitro беше открита сезонността на тяхната морфогенна активност, която се проявява в процеса на образуване на микротуберкули в растенията от епруветка, както и в образуването на столони.
  • Бяха открити някои характеристики на индукция на растежа на изолирани столони при променящи се условия на тяхното култивиране in vitro. Регенерантите, получени от столони, имат по-висок капацитет за туберкулоза в сравнение с оригиналните меристемни растения.
  • Разработена е ефективна техника за in vitro култивиране на столони.
  • Установена е сезонна зависимост на образуването на калус в растения от епруветка, индуцирани от столони.
  • Установено е, че процесът на туберкулоза зависи от съдържанието на въглехидрати и е фенотипна реакция на генотипите на картофите. Сравнението на туберкулозата на различни генотипове картофи (оригинален сорт Жуковски-ранний и неговата устойчива на температура регенерираща линия) показа двусмислена реакция за редица характерни параметри на растеж, развитие и индекс на добив на ниво растения от епруветка. Най-съществената разлика е повишеното започване и растеж на грудки в клетъчно модифицирани растения под въздействието на висока концентрация на захароза в хранителната среда в сравнение с оригиналния сорт Жуковски-ранний.
  • Установено е, че процесът на иницииране и скоростта на растеж на микроклубените в зависимост от концентрацията на захароза са еднопосочни, но не еднакви, тъй като масата на образуваните клубени в крайната фаза на техния растеж се определя до голяма степен от генотипа и следователно изисква диференцирани условия за започване и растеж на клубени in vitro.
  • Установена е зависимостта на действието на въглехидратите и хормоните в процеса на диференциация на клетките на картофения столон в тъканна култура in vitro, което води до активиране на морфогенетичната потентност на растенията.

Практическо значение. Показана е възможността за използване на in vitro столон култура в практическата биотехнология на картофите. Регенерантите, получени от столонната култура, имат значително по-висока скорост на образуване на микроклубени и са свободни от вируси и патогени, което дава възможност за създаване на нова технология на микроразмножаване, за да се ускори въвеждането им в производството на картофени семена.

Апробация на работата: Материалите на дипломната работа са докладвани / представени на следните конференции, симпозиуми, срещи:

  • Актуални проблеми и перспективи за развитие на физиологията на растенията, Душанбе, 2004 г.;
  • Трансгенни растения и биобезопасност, Москва, 2004 г.;
  • Икономиката и науката на Горно-Бадахшанската автономна област: минало, настояще, бъдеще, Хорог, 2005 г.
  • Използване на подобрен материал в производството на семена от картофи, Muminobad, 2005.
  • Конференция на младите учени на Таджикския аграрен университет, Душанбе, 2003-2005 г.
  • Физиологични и молекулярно-генетични аспекти на опазването на биоразнообразието, Вологда, България, 2005 г.
  • Международен конгрес BioVision Александрия, 2006 г

Структура и обхват на работата : Работата се състои от въведение, преглед на литературата, експериментална част, включваща описание на материалите и методите, резултатите от изследванията и тяхното обсъждане, заключения и списък с литература. Работата е представена на 117 страници, съдържа 26 фигури, 9 таблици. Брой цитирани източници 125.

Експериментално

Обект на изследване. Като обектЗа изследване са използвани сорт картофи (Solanum tuberosum L.) Жуковски ранен и термоустойчива линия (TU-регенеранти), получена от сорта Жуковски ранен (Давлятназарова и др., 2003). В Република Таджикистан ранният сорт Жуковски се утвърди като обещаващ високодобивен сорт и е в процес на райониране. Тези растения са прехвърлени в хранителна среда, като се използва култура от апикални меристеми по препоръка на Института по картофено земеделие на Руската академия на селскостопанските науки (2000) и според O.S. Мелик-Саркисов и др.(1988).

Образуване на столонin vitro. В експериментите са използвани картофени растения от епруветка от ранния сорт Жуковски. За in vitro култивиране на растения, хранителна среда Murashige and Skoog (MS), съдържаща 0,6% захароза и 1; 1,5; 2,5 mg/ml кинетин в зависимост от целите на експеримента.

Растенията се отглеждат в светла стая с осветеност 6000 lux, с 16-часов фотопериод и температура +200C. За индуциране на столони се използва следният метод: растенията от епруветка се държат на светлина в продължение на 12 часа, след което се поставят на тъмно при +22°C за 20-25 дни. През целия период на образуване на столон хранителната среда в епруветките не е променяна. Височината на растенията и дължината на столона се измерват на всеки 10–15 дни.

Култивиране на столониin vitro. В работата са използвани картофени меристемни растения, култивирани in vitro, сортове Жуковски ранен и Пикасо (средно късен). Култивирането на изолирани столони се извършва в среда на Murashige Skoog (MS) с добавяне на 3-8% захароза, 0,1-1,0 mg/l кинетин, 0,1-0,5 mg/l -нафтилоцетна киселина (NAA) на тъмно в продължение на 8-30 дни, с прехвърляне на светлина при +220C. Растенията се отглеждат при 16-часов фотопериод и температура+22…+230С. През целия период на култивиране на столони хранителната среда не е променяна.

За експерименти върху столон- и туберизация са използвани 5-6 mm столони. За да се предотврати изчерпването на хранителната среда, се използват епруветки с големи размери (32X270 mm). След образуването на регенеранти от столонови сегменти, растенията се отрязват по обичайния метод. Височината на растението, дължината на столона и началото на клубените се измерват на всеки 30 дни.

Условия за образуване на картофени микроклубени. В работата са използвани картофени регенеранти, получени на базата на ранен сорт Жуковски, носещи постоянно експресиращи гени за устойчивост на топлина (TU-регенеранти), и контролни регенеранти на ранен сорт Жуковски. Тези растения се размножават чрез in vitro клониране върху MS среда, съдържаща 0,7% агар и витамини. Растенията се отглеждат при 16 часа дневна флуоресцентна светлина.

В опитите са използвани еднолистни резници, засадени на MS среда с 6% агар и витамини, съдържащи от 2 до 9% захароза (в зависимост от варианта), с или без добавяне на 0,5-1,5 mg/l кинетин или нафтилоцетна киселина (NAA). Растенията се култивират в продължение на 70 дни при 16 часа светлина или на тъмно. На всеки 5 дни се записва броят на образуваните грудки, а в края на експеримента - мокрото тегло на всички органи на регенерираните растения: корени, издънки с листа и грудки. Съдържанието на вируси в регенерантите се определя чрез ензимен имуноанализ (ELISA). Необходимите реактиви за анализ на вируси са получени от Института по картофено земеделие на Руската академия на селскостопанските науки (Коренево, България). Опитите се повтарят 2-3 пъти. Анализирани са 25 регенерирани растения. Графиките и таблиците показват осреднените аритметични стойности на всички експерименти.

РЕЗУЛТАТИ ОТ ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Образуване на картофени столони в зависимост от

срокове за засаждане на резнициин витро

Таблица 1

Зависимост на образуването на столон от времето на рязане

растения от епруветка (% растения със столони)