За грипния вирус
2.1. Прикрепване на вируса към клетките
Накратко прегледахме структурата на грипните вириони и процеса, чрез който вирусните РНК кодират един или повече протеини. Сега да се обърнем към размножаването на грипните вируси.
Вирусите са изключително вътреклетъчни паразити, те не могат да се възпроизвеждат извън клетката. Появата на нови инфекциозни частици трябва да се случи вътре в клетката. Влизайки в клетките, вирусите започват да паразитират в структурата на гостоприемника за възпроизвеждане на вирусно потомство. Всички събития, случващи се в клетка, заразена с вирус, се наричат инфекциозен цикъл или вирусна репликация. Вирусолозите изкуствено разделят инфекциозния цикъл на няколко етапа, за да улеснят изучаването му. Тези стъпки включват прикрепване и влизане на вириона, транслация на иРНК в протеин, репликация на генома (създаване на повече РНК или ДНК), натрупване на нови частици и излизане на частици от клетката. Ще разгледаме всеки от тези етапи и след това ще обсъдим как грипният вирус ни заразява и причинява заболяване.
Нека се спрем на първия етап - прикрепването на вириона към клетката. Да вземем обикновена клетка, която, сигурен съм, е позната на всички. Но няма да е излишно да се повтори.
Снимка 8.
Виждате, че клетката има значителна бариера за проникването на каквото и да било в нея – цитоплазмената мембрана. Вирусите използват различни механизми, за да преодолеят това препятствие. Но общото между тях е, че вирионите първо трябва да се прикрепят към рецептор на цитоплазмената мембрана, за да влязат в клетката. Всеки вирус има специфичен рецептор, към който се свързва, а от своя страна има специфичен вирусен протеин, който се свързва с клетъчния рецептор. На фиг. 9 показва грипен вирион, прикрепен към негоклетъчен рецептор.
Снимка 9.
Можете да видите отделните "шипове" на вириона, съответстващи на клетъчната структура. Шиповете на грипния вирус, които се прикрепят към клетъчен рецептор, се наричат НА протеин - хемаглутинин. Клетъчният рецептор е сиалова киселина, малко количество захар, свързано с много различни протеини на клетъчната повърхност. На фиг. 10 показва как изглежда сиаловата киселина.
Снимка 10.
Вляво е показан клетъчен протеин, прикрепен към цитоплазмената мембрана. Вътрешността на клетката, цитоплазмата, е показана по-долу. Част от протеина преминава през мембраната и части от цитоплазмената и извънклетъчната страна също са видими. Сферите са захари, прикрепени към множество протеини (протеин + захар = гликопротеин). Сиаловата киселина винаги е последната захар във веригата, която се свързва с протеина. Химическата структура на сиаловата киселина е показана вдясно; следващата захар (вдясно) е галактоза. Вирионите на грипа се прикрепват към клетките, когато НА поема много малко сиалова киселина.
Захарта в сравнение с НА всъщност е много малка - тя се побира в малък джоб в точката на шипа. На фиг. 11 е молекулярен модел, показващ как НА се свързва с аналог на сиалова киселина. Сферичният край на HA е показан в горната част на фиг. 11. Малки червени и бели сфери показват местата на бъдещо прикрепване на сиалова киселина - джобове в горния край на НА.
Снимка 11.
Ние показахме как грипният вирион се прикрепя към клетъчната повърхност. Той седи там доста здраво, но все още е извън клетката. След това ще разгледаме как попада вътре, по-точно как вирусните РНК попадат в клетката.
2.2.Прикрепване на грипния вирус към клетките: ролята на различнисиалови киселини
Вече видяхме, че свързването на всички щамове на вируса на грип А изисква сиалови киселини. Въпреки това, има голям брой сиалови киселини, които са химически различни една от друга, и щамовете на грипния вирус, в зависимост от това, променят своята прилика. Тези разлики могат да определят кои видове животни ще бъдат заразени.
Може да се види от примера по-долу, че сиаловата киселина е прикрепена към захарната галактоза чрез така наречената алфа(2,3) връзка. Това означава, че въглеродният атом в позиция номер 2 на хексозата на сиаловата киселина е свързан чрез кислороден атом към въглерода в позиция 3 на галактозната хексоза.
Снимка 12.
Щамовете на вируса на птичия грип се прикрепят предимно към сиалови киселини, прикрепени към галактоза чрез алфа (2,3) връзка. Това е основната сиалова киселина в епителните клетки на храносмилателния тракт на патиците. Обратно, щамове на човешки грипен вирус се прикрепят за предпочитане към сиалови киселини, прикрепени към галактоза чрез алфа (2,6) връзка. Това е основният тип сиалова киселина, присъстваща в епителните клетки на човешкия респираторен тракт. Прикрепени чрез алфа(2,3), сиаловите киселини се намират върху ресничести епителни клетки, които са малцинство в човешките дихателни пътища, а също и върху някои епителни клетки на долните дихателни пътища.
Тази рецепторна специфичност има различни последици за човешката инфекция с щамове на вируса на птичия грип. Например, високопатогенните вируси на птичия грип H5N1 се репликират само в ограничена степен в човешкия респираторен тракт поради наличието на някои клетки със сиалови киселини, прикрепени чрез алфа(2,3) връзка. Въпреки това, за ефективно предаване от човек на човек, вирусите трябваптичият грип разпознава сиаловите киселини, използвайки алфа (2,6) връзката. В съответствие с тази хипотеза, резултатите от изследванията на ранните изолати на грипния вирус от пандемиите от 1918, 1957 и 1968 г. предполага се, че тези вируси преференциално разпознават сиалови киселини, свързани чрез алфа (2,6) връзка.
Свинските трахеални епителни клетки произвеждат сиалови киселини, свързани чрез алфа (2,3) и алфа (2,6) връзка. Смята се, че затова прасетата могат да бъдат заразени с щамове както на птичия грип, така и на човешкия грип и да служат като „миксер“ за производството на нови вируси. Въпреки това, Питър Палесе изразява съмнения относно това в „Великата инфлуенца“ на Джон Бари:
„Д-р Питър Палис… счита теорията за „смесителя“ като незадължителна за обяснение на антигенната вариация: „Също толкова възможно е съвместната инфекция с птичи и човешки вирус при хора в една и съща белодробна клетка да произведе вирус… Няма причина смесването да не може да се случи в белите дробове, било то на прасе или на човек. Не е ясно дали тези типове рецептори за сиалова киселина отсъстват при други видове. Не е очевидно, че тези птичи рецептори всъщност са различни от човешките рецептори и с промяна на една аминокиселина вирусът може да процъфтява дори по-добре в различен гостоприемник."
Препоръчително четене.
- Ito T, Couceiro JN, Kelm S, Baum LG, Krauss S, Castrucci MR, Donatelli I, Kida H, Paulson JC, Webster RG, & Kawaoka Y (1998). Молекулярна основа за генериране при свине на вируси на грип А с пандемичен потенциал. Journal of Virology, 72, 7367-7373.
- Матросович М, Тузиков А, Бовин Н, Гамбарян А, Климов А, Кастручи М.Р., Донатели И и Каваока Ю. (2000). Ранни промени в рецептор-свързващите свойства на H1,H2 и H3 хемаглутинини на вируса на инфлуенца по птиците след въвеждането им в бозайници. Journal of Virology, 74, 8502-8512.
2.3.Навлизане на РНК на грипния вирус в клетките
В последния разговор оставихме непокътнатия вирион на повърхността на клетката. Следващият етап е въвеждането на вирусна генетична информация (за грипния вирус това са отделни РНК сегменти) в клетката, за да се даде възможност за възпроизвеждане. Механизмът, илюстриран на фиг. 13 включва етап, в който вирусът е насочен от антивирусните адамантани.
Снимка 13.
Процесът на навлизане на грипния вирус в клетките е най-изясненият от всички известни механизми за навлизане на вируси. След прикрепване на вириона към сиалова киселина, която има рецептори на клетъчната повърхност, комплексът вирус-рецептор навлиза в клетките чрез ендоцитоза, процес, при който клетките обикновено приемат молекули от извънклетъчната течност. Тъй като ендозомните везикули, съдържащи вирусни частици, се придвижват към клетъчното ядро, тяхното рН намалява. Тази промяна в pH завършва клетъчния канал, изпомпващ протони (H+) във везикулата. Когато ендозомалното рН достигне 5,0, вирусният НА протеин претърпява конформационно пренареждане. Тази промяна излага слетия пептид НА на къса хидрофобна последователност, вмъквайки го в ендозомалната мембрана, която след това се слива с вирусната обвивка. Когато това се случи, вирусните РНК навлизат в цитоплазмата. След това се транспортират до клетъчното ядро, където започва размножаването.
В грипния вирион вирусните РНК не са изложени, тъй като вирусните протеини, включително протеина M1, са прикрепени към тях. Този протеин образува обвивката, която е под липидната мембрана на вириона. За съжаление, ако вирусните РНК се прикрепят към протеина M1, когатоизлязат от вириона, те не могат да достигнат до ядрото. За да реши този проблем, грипният вирион има множество копия на протеин, наречен М2 в мембраната си. Този вирусен протеин образува канал в мембраната, който активно изпомпва протони от ендозома във вътрешността на вириона. Тези протони понижават pH във вириона, освобождавайки вирусните РНК от M1. В този случай РНК може да влезе в ядрото.
М2 йонният канал, който е мишена за антивирусни адамантани, е показан на фиг. 14. Тези образувания запушват канала и не позволяват на протоните да се изпомпват във вириона. В присъствието на адамантани, вирусните РНК трябва да се прикрепят към M1, поради което не могат да достигнат до ядрото. Поради това вирусната репликация се потиска. Резистентността към адамантани е възможна при промяна в аминокиселините, които правят М2 канала. Такива промени не позволяват на лекарството да запуши канала.
Снимка 14.
2.4.Разцепването на НА е необходимо условие за инфекциозност
Хемаглутининът на грипния вирус (НА) е вирусен протеин, който се свързва с клетъчните рецептори (виж 2.1.). НА също така играе важна роля при навлизането на вирусна РНК в клетката, като предизвиква сливането на вирусната и клетъчната мембрана. НА трябва да бъде отделена от клетъчни протеази, за да стане активна като слят протеин.
НА върху грипния вирион е тример - изграден е от три копия на полипептида НА. Мястото на разцепване на клетъчните протеази на HA протеина е разположено близо до вирусната мембрана.
Снимка 15.
На фиг. 15, сферичният край на НА протеина, който се прикрепя към клетъчните рецептори, е показан отгоре, а вирусната мембрана отдолу. За яснота само мястото на разцепване на НА е маркирано. Неразцепената форма на протеина се нарича НАО; след разцепване от клетъчен ензим се образуват два протеина, наречени НА1 (син) и НА2(червен). Двете субединици остават заедно на повърхността на вирусната частица. Новият амино(N)-терминален регион на разцепения НА2 съдържа последователност от хидрофобни аминокиселини, наречена слят пептид. По време на навлизането на грипния вирус в клетките, слетият пептид се вмъква в ендозомалната мембрана и предизвиква сливането на вирусната и клетъчната обвивки. Следователно вирусните РНК на грипа могат да навлязат в цитоплазмата. Процесът на сливане е описан в предишния параграф.
Ако НА протеинът не се разцепи, за да образува НА1 и НА2, сливането не настъпва. Следователно, грипните вируси с неразцепена НА не са заразни. Разцепването на вирусната НА настъпва след като новосинтезираните вириони напуснат клетката. Грипните вируси се размножават ефективно в яйцата поради наличието на протеаза в алантоисната течност, която е способна да разгражда НА. Репликацията на много грипни вирусни щамове в клетъчни култури обаче изисква добавянето на подходяща протеаза (обикновено трипсин) към средата.
При хората репликацията на грипния вирус е ограничена до респираторния тракт, тъй като това е единственото място, където се произвежда HA-разцепващата протеаза. Въпреки това, НА протеинът на високопатогенните H5 и H7 щамове на вируса на птичия грип може да бъде разцепен от протеази, произведени в много различни тъкани. В резултат на това тези вируси могат да се репликират в много органи на птиците, включително далак, черен дроб, бели дробове, бъбреци и мозък. Това свойство обяснява способността на щамовете H5N1 на вируса на птичия грип да се репликират извън човешкия респираторен тракт.
Подобно на HA протеините на високопатогенните H5 и H7 вируси, HA щамът на грипния вирус 1918 може също да бъде разцепен от повсеместни клетъчни протеази. Следователно вирусът може да се размножава в клетъчни култури без добавяне на трипсин.
НА протеини H5 и H7имат много основни аминокиселинни остатъци в мястото на разцепване НА1-НА2, което позволява разцепване от широко представени протеази. Но HA на грипния вирус H1 от 1918 г. няма това свойство. Също така, 1918 N1 не беше в състояние да привлече протеази, които биха разцепили НА, т.е. нямаше механизъм, който да позволи на щама A/WSN/33 на грипния вирус да пролиферира в клетки без трипсин. Разбирането как HA протеинът на вируса 1918 H1 може да бъде разцепен от протеази е от основно значение за разбирането на високата патогенност на този щам.
Препоръчително четене.
Chaipan, C., Kobasa, D., Bertram, S., Glowacka, I., Steffen, I., Solomon Tsegaye, T., Takeda, M., Bugge, T., Kim, S., Park, Y., Marzi, A., &Pohlmann, S. (2009). Протеолитично активиране на хемаглутининовия вирус на грипа от 1918 г. Journal of Virology, 83 (7), 3200-3211 DOI:10.1128/JVI.02205-08.