8. Методи за серологична диагностика

Серологичните методи на изследване, като правило, са от допълнително значение и само в някои случаи, когато се извършва оперативен и ретроспективен епидемиологичен анализ, техните резултати могат да бъдат решаващи.

За серологична диагностика на холера се използват имунологични реакции, които откриват специфични антитела в кръвния серум на пациенти, възстановени пациенти и вибрионосители, както и ваксинирани специфични антитела: аглутинини, антитоксини и виброцидни антитела.

Аглутинините, вибриоцидните антитела и антитоксините се появяват при пациенти с холера на 5-7-ия ден от началото на заболяването.

Препоръчително е да се изследват сдвоени серуми с интервал от 7 - 10 дни. Първата проба трябва да се вземе на 5-7-ия ден за оперативна диагностика, а втората - след 7-10 дни и повече - за ретроспективна.

Кръвта за серологични изследвания се взема от вена, а при липса на такава възможност - от пръст. Взема се 1-5 ml кръв от вената, след съсирване съсирекът се отлепва от стената на епруветката със стерилна стъклена пръчка или платинена бримка. Епруветките се съхраняват в хладилник и се транспортират до лабораторията охладени (в термос, хладилна чанта и др.). В лабораторията серумът се инактивира при температура (56,0 +/- 0,5) °C за 30 минути.

Ако кръвта се взема в деня на реакцията, епруветките със съсирена кръв трябва да се центрофугират за 10-15 минути. при 3000 об/мин Ако не е възможно да се изследва серумът, той незабавно се съхранява в ампули при температура (4,0 +/- 0,5) °C. Кръвта се взема от пръста в обем от 0,4 ml и се въвежда в стерилен пеницилинов флакон или епруветка с 1,6 ml 0,9% разтвор на натриев хлорид (1: 5).

А. Откриване на антихолерни антитела по метода на разширената реакция на аглутинация

Тестовият серум се разрежда с 1% пептонна вода с pH 7,5 +/- 0,1 в обем от 1 ml от 1:10 до 1:640. Като антиген се използва 3-часова бульонна култура, изолирана в този фокус, или се изследва в 3 реда с култури от холерни вибриони (серовари Ogawa, Inaba и O139 серогрупи). 1 капка антигенна култура се добавя към епруветка със стрит серум и се поставя в термостат за 1 час, след това в хладилник до сутринта при температура (4,0 +/- 0,5) ° C, след което се отбелязват резултатите. Реакцията е последвана от антигенни и серумни контроли.

При определяне на титъра на реакцията се вземат предвид разрежданията с аглутинация с 3-4 кръста.

Резултатът от изследване на серума на пациента с реакция на аглутинация при разреждане 1:40 и повече се счита за приблизително положителен.

Диагностичната стойност е не по-малко от 4-кратно увеличение на титрите на антителата.

B. Реакцията на индиректна хемаглутинация (RIHA) с диагностикум еритроцитна холера антигенна

RNGA е предназначен за откриване на пълни антитела в кръвния серум. Това е доста специфична и чувствителна двукомпонентна реакция. Чувствителността значително надвишава реакцията на аглутинация. Необходимите съставки, техниката на стадиране в макро- и микрообеми са посочени в ръководството за еритроцитния холерен антигенен диагностикум.

Резултатът от изследването на серума на пациента при разреждане 1:40 и повече се счита за приблизително положителен.

Диагностичната стойност е не по-малко от 4-кратно увеличение на титрите на антителата.

B. Реакция на неутрализация на антиген (RNAg)

За откриване на антитела в кръвния серум с помощта на диагностикума на еритроцитния холерен имуноглобулин се използва RNAg. Реакция на неутрализация на антигена - високоспецифична трикомпонентнареакция. Неговият принцип е специфичната неутрализация на добавения антиген както с пълни, така и с непълни антитела, които се появяват по-рано от останалите. Необходимите съставки, методът на стадиране в макро- и микрообеми са посочени в инструкциите за употреба на еритроцитния холерен имуноглобулин диагностикум.

Когато се използва реакционната система RNHA и RNAg, не е необходимо да се настройва специфичен контрол с всеки тест серум, т.к. тези две реакции взаимно контролират получените резултати.

Резултатът от изследването на серума на пациента в RNAg при разреждане 1:50 (1:80) и по-горе се счита за приблизително положителен.

Диагностичната стойност е не по-малко от 4-кратно увеличение на титрите на антителата при изследване на сдвоени серуми в RNHA и RNAg.

Вибриоцидните антитела в кръвта на пациентите се откриват и достигат максимални стойности от 10 (-4) - 10 (-8) до 10 - 12 дни. Принципът на метода във всичките му разновидности е, че при наличие на вибриоцидни антитела няма размножаване на холерни вибриони.

При провеждане на серологични изследвания в огнището, причинено от причинителя на холера на определен серовар, в реакцията се използва един щам на съответния серовар, при липса на тези данни се използват два щама от двата серовара.

Материали и оборудване:

- тестови серуми, инактивирани чрез нагряване в продължение на 30 минути. при температура (56,0 +/- 0,5) ° С;

- сух комплемент или прясно получен серум от морско свинче в разреждане 1:20;

- 0,9% разтвор на натриев хлорид pH 7,2 +/- 0,1;

- Vibrio cholerae щамове на серовари Ogawa и Inaba, типични в S-форма, нечувствителни към комплемента;

- Петри с алкален агар;

- термостат на (37.0 +/- 1.0) °С.

Метод за настройка на реакцията

Комплементът, разреден с 0,9% разтвор на натриев хлорид 1:20, се излива в два реда епруветки от 0,9 ml. 0,1 ml от тестовия серум се добавя към първата епруветка и след старателно смесване 0,1 ml се прехвърлят последователно към разреждане 10 (-10), като се получават десетократни разреждания на серума в обем от 0,9 ml. Серумното титруване се извършва върху лед, който се поставя във всеки контейнер.

От еднодневна агарна култура на Vibrio cholerae се приготвя суспензия в 0,9% разтвор на натриев хлорид, съдържащ 1-2 х 10 (4) м.к. в 1 ml. Със стерилна градуирана пипета получената суспензия от 0,1 ml се въвежда в епруветки със стрит серум.

Необходими са следните контроли: а) контрол на комплемента (0,9 ml комплемент и 0,1 ml култура); б) серумен контрол (0,8 ml 0,9% разтвор на натриев хлорид, 0,1 ml серум и 0,1 ml култура); в) контролна култура (0,9 ml 0,9% разтвор на натриев хлорид и 0,1 ml култура).

Поставка с епруветки се поставя във водна баня или термостат при температура (37,0 +/- 0,5) °C за 1 час, като предварително се инокулират 2 плочки с алкален агар от епруветката за контрол на културата, за да се определи действителната концентрация на живи вибриони в експерименталната суспензия (контрола на разреждането).

След 1 час стелажът отново се поставя върху лед и от всяка епруветка с отделна стерилна пипета се засява 0,1 ml култура върху плака с алкален агар рН 7,0 +/- 0,1. Посевът се разпределя равномерно по повърхността на чашата чрез разклащане или шпатула. Чашките се поставят за 18 - 24 часа в термостат при температура (37,0 +/- 0,5)°С, след което се отчита броят на порасналите колонии.

При култури епруветките с контролна култура трябва да отглеждат определен брой колонии, близки до контролата за разреждане.

Взема се предвид вибриоцидният титърмаксималното разреждане на серума, което причинява смъртта на най-малко 50% от клетките на V. cholerae, което се открива чрез инокулация върху агарови плаки в петриеви панички в сравнение с броя на порасналите колонии от епруветка за контрол на комплемента.

Пример за изчисление: при засяване от епруветки със серумно разреждане 10(-1); 10(-2); 10(-3); 10(-4); 10(-5); 10(-6); 10(-7) и т.н. на чашите съответно увеличени 0; 0; 5; 10; 15; тридесет; 38 и т.н. колонии. При посяване от епруветката за контрол на комплемента, също след един час инкубация при температура (37,0 +/- 0,5) ° C, нарастват 36 колонии, 50% от този брой ще бъдат 18. От 5-та епруветка нарастват 15 колонии, т.е. по-малко от 50% от броя на колониите в контролата (18), в следващите - 30, т.е. повече от 50% от същия показател. Разреждането на серума в 5-та епруветка е 10(-5), следователно вибриоцидният титър в този пример ще бъде 10(-5).

Определяне на вибриоцидни антитела (VA) в кръвен серум на базата на въглехидратна ферментация

Отсъствието или наличието на VA се оценява по ферментацията на захарозата, регистрирана с помощта на индикатор.

Материали и оборудване:

- инактивиран кръвен серум;

- щамове на Vibrio cholerae серовар Ogawa и Inaba;

- добавка, разредена 1:20 с 1% пептонна вода, съдържаща 1% захароза и 1% индикатор на Андреде;

- термостат на (37.0 +/- 1) °С.

Метод за настройка на реакцията

Комплементът, разреден 1:20 с 1% пептонна вода със захароза и индикатор на Андреде, се налива в епруветки от 0,45 ml. 0,05 ml от тестовия серум се добавят към първата епруветка и след пълно разбъркване 0,05 ml от сместа се прехвърлят във втората епруветка, от втората към третата и т.н. (преди разреждане 10(-5) - 10(-9)). Пригответе суспензия от 18 - 20 часова агарна културахолерен вибрион и се разрежда с 1% пептонна вода до концентрация 10(3) mc/ml. Добавете 0,45 ml от суспензията към всички епруветки и поставете в термостат.

Настройката на реакцията е придружена от следните контроли:

- 0,45 ml 1% пептонна вода, съдържаща 1% захароза и 1% индикатор Andrede + 0,05 ml тестов серум + 0,45 ml културална суспензия - серумна контрола;

- 0,45 ml комплемент със захароза и индикатор + 0,45 ml култура - контрол на комплемента;

- 0,45 ml 1% пептонна вода със захароза и индикатор + 0,45 ml култура - културална контрола;

- 0,45 ml 1% пептонна вода със захароза и индикатор + 0,05 ml тестов серум - контрол на серумната стерилност.

След 5-6 часа реакцията се записва. В същото време при контрола (с изключение на контрола на серумната стерилност) цветът на съдържанието на епруветките трябва да стане червен или розов. Промяната в цвета на индикатора в епруветките от работната серия, свързана с ферментацията на захароза чрез умножаване на вибриони, показва липсата на вибриоцидни антитела в тестовия серум. За вибриоцидния титър се взема най-високото разреждане на серума, при което цветът на съдържанието на епруветките остава непроменен или неговият интензитет се различава значително от цвета на контролните проби. Резултатът се изразява като десетичен логаритъм от разреждането на серума, взет с противоположния знак.

Забележка. За определяне на RVA при холера, причинена от серогрупа O139 vibrio cholerae, изолираният във фокуса щам не може да се използва поради възможната му чувствителност към комплемента. В тези случаи се препоръчва ctx-клонът на Vibrio cholerae O139, предложен от специалистите на Ростовския НИПЧИ, да бъде изпратен за депониране в Държавната колекция от патогенни бактерии "Микроб" (РосНИПЧИ "Микроб").

За откриване на токсин-неутрализиращи антитела в кръвния серум на пациенти с холера и вибрионосители е предназначен RNHA с еритроцитна холера ентеротоксичен диагностикум (ECED), при който инфекцията се причинява от вибрио холера O1 и O139 серогрупи. Токсинонеутрализиращите антитела се появяват на 5-7-ия ден от заболяването, достигайки максимум на 14-21-ия ден, след което титърът им постепенно намалява, но продължава по-дълго от другите антитела. Имуноглобулините към холерния токсин, в сравнение с вибриоцидните и други специфични холерни антитела, циркулират по-дълго в кръвния серум след инфекция (до 8-10 месеца или повече). Условно положителен титър на RNHA с ECED трябва да се счита за 1:160 и повече. Препоръчително е да се изследват сдвоени серуми.

Резултатът от RNGA с ECED ни позволява да заключим, че токсигенността (епидемичността) на щама Vibrio cholerae, циркулиращ в огнището, включително без изолиране на културата.