Биотехнологични етапи на микроразмножаване на растения
Микроразмножаване и здраве на растенията
Етапи на микроразмножаване на растенията
Процесът на клонално микроразмножаване може да бъде разделен на 4 етапа:
1. Избор на растение донор, изолиране на експланти и получаване на добре развиваща се стерилна култура.
2. Всъщност микроразмножаване, когато се постигне максимален брой меристематични клонове.
3. Вкореняване на размножени издънки с последващо адаптиране към почвените условия и, ако е необходимо, отлагане на регенерирани растения при ниска температура (+2 o C, +10 o C).
4. Отглеждане на растения в оранжерия и подготовката им за продажба или засаждане на полето.
За култивиране на тъкани всеки от четирите етапа изисква използването на специфичен състав на хранителна среда.
На първия етап е необходимо да се получи добре развиваща се стерилна култура. В случаите, когато е трудно да се получи първоначална стерилна култура на експлант, се препоръчва да се въведат антибиотици (тетрациклин, бензилпеницилин и др.) В хранителната среда в концентрация 100-200 mg / L. Това се отнася преди всичко за дървесни растения, които са склонни да натрупват вътрешна инфекция.
На първия етап, като правило, се използва среда, съдържаща минерални соли по рецептата на Murashiga и Skoog, както и различни биологично активни вещества и стимулатори на растежа (ауксини, цитокинини) в различни комбинации в зависимост от обекта. В случаите, когато има инхибиране на растежа на първичния експлант, поради освобождаването на токсични вещества (феноли, терпени и други вторични съединения) в хранителната среда, той може да бъде отстранен с помощта на антиоксиданти. Това е възможно по два начина:или чрез промиване на експланта със слаб разтвор в продължение на 4-24 часа, или чрез директно добавяне към хранителната среда. Като антиоксиданти се използват: аскорбинова киселина (1 mg/l), глутатион (4–5 mg/l), дитиотриетол (1–3 mg/l), диетилдитиокарбамат (2–5 mg/l), поливинилпиролидон (5000–10000 mg/l). В някои случаи е препоръчително да добавите адсорбент към хранителната среда - активен въглен в концентрация 0,5-1%. Продължителността на първия етап може да варира от 1 до 2 месеца, в резултат на което се наблюдава растеж на меристемни тъкани и образуване на първични издънки.
Етап 2 - същинското микроразмножаване. На този етап е необходимо да се постигне максимален брой мериклони, като се има предвид, че с увеличаване на субкултивациите се увеличава броят на регенерираните растения с анормална морфология и е възможно да се наблюдава образуването на мутантни растения.
Както и в първия етап, се използва хранителна среда по рецептата на Murashiga и Skoog, съдържаща различни биологично активни вещества, както и регулатори на растежа. Съотношението и концентрацията на цитокинини и ауксини, въведени в хранителната среда, играят основна роля при избора на оптимални условия за култивиране на експланти. От цитокинините най-често се използва BAP в концентрации от 1 до 10 mg/l, а от ауксините IAA и NAA в концентрации до 0,5 mg/l.
Етапи 3 и 4 - вкореняване на микроиздънките, последващото им адаптиране към почвените условия и засаждане на полето са най-отнемащите време етапи, от които зависи успехът на клоновото микроразмножаване. На третия етап, като правило, те променят основния състав на средата: намаляват концентрацията на минерални соли с коефициент два, а понякога и четири пъти според рецептата на Murashiga и Skoog или я заменят със среда на White, намаляват количеството захар до 0,5-1%и напълно изключва цитокинините, оставяйки само един ауксин. Като стимулатор за образуване на корени се използва β-индолил-3-маслена киселина (IMA), IAA или NAA.
Вкореняването на микроиздънките се извършва по два начина:
1) излагане на микроиздънки в продължение на няколко часа (2–24 часа) в стерилен концентриран разтвор на ауксин (20–50 mg/l) и последващото им култивиране върху агарна среда без хормони или директно в подходящ почвен субстрат (импулсно третиране);
2) директно култивиране на микроиздънки за 3-4 седмици върху хранителна среда, съдържаща ауксин в ниски концентрации (1-5 mg / l, в зависимост от обекта на изследване). Наскоро беше предложен метод за вкореняване на растения от епруветка при хидропонни условия. Този метод позволява значително да се опрости етапът на вкореняване и в същото време да се получат растения, адаптирани към природните условия. За картофите е възможно да се използва хидропоника без субстрат за производство на миниклубени. Засенчването на долната част на съдовете за култура с плътна черна материя или добавянето на активен въглен към хранителната среда насърчава вкореняването на микроиздънките.
Трансплантацията на регенерирани растения в субстрата е решаваща стъпка, която завършва процеса на клонално микроразмножаване. Най-благоприятното време за трансплантация на растения от епруветка е пролетта или началото на лятото.
Растенията с два или три листа и добре развита коренова система се изваждат внимателно от колби или епруветки с пинсети с дълъг връх или специална кука. Корените се измиват, за да се отстранят остатъците от агар и се засаждат в почвен субстрат, предварително стерилизиран при 85-90 ° C за 1-2 часа.За повечето растения като субстрати се използват торф и пясък (3: 1); торф, тревна почва, перлит(1:1:1); торф, пясък, перлит (1: 1: 1). Изключение прави семейството на орхидеите, за което се приготвя субстрат, състоящ се от мъх сфагнум, смес от торф, букови или дъбови листа, борова кора (1: 1: 1).
Предварително подготвеният почвен субстрат се напълва със сандъчета или торфени саксии, в които се отглеждат регенерирани растения. Саксиите с растения се поставят в оранжерии с контролиран температурен режим (20-22 ° C), осветеност не повече от 5 хиляди лукса и влажност 65-90%. За по-добър растеж на растенията се създават условия за изкуствена мъгла. В случаите, когато не е възможно да се създадат такива условия, саксиите с растения се покриват със стъклени буркани или найлонови торбички, които постепенно се отварят, докато растенията се адаптират напълно.
20-30 дни след засаждането добре вкоренените растения се подхранват с разтвори на минерални соли на Knudson, Murasig и Skoog, Chesnokov, Knop (в зависимост от вида на растението) или комплексен минерален тор. Докато растенията растат, те се поставят в големи контейнери с пресен субстрат. По-нататъшното отглеждане на аклиматизираните растения съответства на приетите култивационни практики за всеки отделен растителен вид.
Процесът на адаптиране на растенията от епруветка към почвените условия е най-скъпата и отнемаща време операция. Често след трансплантация на растения в почвата се наблюдава спиране на растежа, падане на листата и смърт на растенията. Тези явления са свързани преди всичко с факта, че в растенията от епруветка се нарушава дейността на устичния апарат, в резултат на което се губи голямо количество вода. Второ, при някои растения в in vitro условия не се образуват коренови косми, което от своя страна води до нарушаване на усвояването на вода и минерални соли от почвата.Поради това е препоръчително да се използва изкуствена микоризация на растенията (за микотрофи) на третия или четвъртия етап от клоновото микроразмножаване, като се има предвид тяхната положителна роля в снабдяването на растенията с минерални и органични хранителни вещества, вода, биологично активни вещества, както и в защитата на растенията от патогени.
Индийски учени предложиха прост метод за предотвратяване на бързото обезводняване на листата на растенията, отгледани ин витро по време на трансплантацията им на полето. Методът се състои в това, че през целия период на аклиматизация листата трябва да се напръскат с 50% воден разтвор на глицерин или смес от парафин или мазнина в диетилов етер (1: 1). Използването на този метод помага да се избегнат дългите и трудни процеси на втвърдяване на растенията от епруветка и гарантира тяхната 100% степен на оцеляване.