Флуоресцентен микроскоп (прав и обърнат)
Светлоопределяща вълна, удряща се върху обект, кара частта от обекта, способна да свети, да свети (препаратът може да бъде специално оцветен с луминесцентни багрила флуорохроми). Луминесценцията се измества към дългата вълнова част от спектъра.
поляризационен микроскоп
Ориентираната (поляризирана) светлина по определен начин, падайки върху обект, който има способността да променя ориентацията на светлинната вълна, формира образ на обекта. Това изображение е изградено със степента на промяна, съответстваща на обекта.
На тъмен фон се наблюдава ярко, ясно цветно изображение на обект с висока разделителна способност с контраст
Обикновено тези видове микроскопи са отразени в техните имена.
Микроскопите с плоско поле от обърнат тип се използват главно за изследване на клетъчни и тъканни култури in vitro. Основната област на приложение е биотехнологията, бактериологията и др.
Глава 2
Понастоящем традиционните методи за контрастиране на изображението на обект (промяна на интензитета на светлината, преминаваща през обекта по различни начини) се прилагат с помощта на допълнителни единици, които се доставят с микроскопи по желание на потребителя или които са вградени в микроскопа. Това се отнася например за методи, които прилагат:
контраст (комбинация от ефекта на фазовия контраст и изследване в поляризирана светлина).
В имената на съвременните микроскопи няма препратки към методите на контрастиране, използвани в тях.
Нека разгледаме накратко някои от горните методи за контрастиране на микрообекти.
2.1. Метод на тъмното поле
Методът на тъмното поле се основава на ефекта, който се постига чрез осветяване на обект с кух конус от светлина, чийто вътрешен отвор трябва да надвишавацифровата апертура на използвания обектив. По този начин нито един директен лъч не влиза в обектива: при липса на обект зрителното поле на микроскопа ще бъде тъмно, а ако е налице, контрастен светъл обект ще се вижда на тъмен фон в отразена или дифузна (дифузно отразена) светлина.
За създаване на тъмно поле в биологичен микроскоп се използват: 1) метод на прорез; 2) Опростен метод, свързан с едновременното
диафрагма на осветителната апертура на кондензатора и изходната апертура на обектива, докато обективът трябва да има ирисова диафрагма или вложка, която ви позволява да намалите изхода на обектива, като го доближите до осветителната апертура, която е оптимална за получаване на ефекта на тъмното поле; 3) използването на специален кондензатор
Методът за изследване в тъмното поле е предложен за първи път от австрийските учени Р. Зигмонди и Р. Зидентопф през 1903 г.
2.2. Метод на фазов контраст
Методът е свързан с промяна на условията на осветеност при наблюдение на нискоконтрастни биологични обекти (микроорганизми, растителни клетки) в неоцветено състояние с цел тяхното визуализиране (контрастиране).
За разлика от метода на тъмното поле, който разкрива само контурите на обекта, методът на фазовия контраст ви позволява да видите елементите на вътрешната структура на разглеждания прозрачен обект. Устройството позволява да се преобразуват фазовите промени на светлинните вълни, преминаващи през обект, в амплитудни промени, в резултат на което стават видими прозрачни микрообекти.
В зависимост от големината на фазовите пръстени и начина на получаването им биват:
1) Положителен фазов контраст, когато фазовият пръстен в лещата е технологично получен чрез ецване, което внася „аванс“ в директно предаваната светлина, докато изображението на обекта с индикаторапречупване, по-голямо от това на средата, се оказва по-тъмно на по-светъл фон (този метод се прилага в домашни устройства
2) Отрицателен фазов контраст (аноптален или фазов контраст на тъмно поле), когато фазовият пръстен в лещата е технологично получен чрез нанасяне на тънък филм върху стъклената повърхност, който внася „лаг“ в директно предаваната светлина, докато изображението на обект с индекс на пречупване по-голям от този на средата изглежда
по-светъл от околния тъмен фон (този метод е приложен в домашното устройство
В микроскопите на японската фирма OLYMPUS има около 5 вида фазови устройства, с различни нива на получаване на фазови промени, които могат да се избират в зависимост от свойствата на наблюдавания обект.
Методът може да се приложи по два начина:
1) разположението на елементи с фазови и светлинни пръстени вътре в оптичните системи съответно на лещата и кондензатора,
2) разположението на тези елементи извън обектива и окуляра вътре в самия микроскоп. Първият метод се реализира с помощта на устройства, съдържащи
фазови обективи и специален кондензатор с комплект светлинни пръстени (вградени в кондензатора или направени под формата на вложки), които се закупуват отделно от микроскопа.
Вторият метод се реализира с помощта на подходящи вложки, които се монтират в равнината на апертурната диафрагма на кондензатора и разширената равнина на изходната зеница на обектива. В този случай се използват конвенционален кондензатор и леща. Най-често този метод се прилага в модерни инвертирани микроскопи.
Фазовите лещи имат вътре фазов елемент (леща или пластина) с пръстен с покритие, който променя фазата и намалява амплитудата на светлинната вълна (фиг. 2). Вътрешен диаметър на пръстенасредно е 1/2 - 2/3 от изходната зеница на лещата, докато светлопропускливостта на пръстена е 10 - 30%, в зависимост от вида на фазовия контраст.
Фазовият кондензатор в равнината на апертурната диафрагма има пластина с прозрачен светлинен пръстен (фиг. 3).
Размерът на светлинния пръстен или по-скоро неговото изображение е избран по такъв начин, че изображението му да съответства (или дори малко по-малко) на размера на фазовия пръстен на лещата. В съвременните микроскопи има два начина за инсталиране на светлинни пластини в кондензатор:
1) подвижна обвивка за съответния обектив е монтирана в равнината на апертурната диафрагма на кондензатора (обикновено обвивката е черна пластмасова част с изрязан светлинен пръстен),
2) използва се въртящо се устройство, фиксирано върху кондензатора; има няколко гнезда - едно празно за светло поле и гнездо със стъклени плочи, върху които с помощта на маска е получен пръстен, пропускащ светлина.
2.3 Изследвания в поляризирана светлина
Методът е свързан с визуализация на обект или негови елементи в поляризирана светлина в резултат на промяна в посоката на поляризацията на светлината и проява на анизотропни свойства на обекта. Характеристика на микроскопа е наличието на полярни филтри в оптичната схема: в осветителната част - поляризатор, а в пролуката между обектива и окуляра - анализатор. Наблюдението се извършва, когато двата полярни филтъра се завъртат един спрямо друг и в същото време се наблюдава максимално потъмняване в изходната зеница на микрообектива.
2.4. Изследвания в светлината на луминесценцията
Методът се основава на наблюдението на микроскопични обекти чрез способността им да светят. В сравнение с конвенционалната микроскопия, светлинно изследванеЛуминесценцията има редица предимства: цветно сияние, висока степен на контраст на светещи обекти на тъмен фон, възможност за изследване както на прозрачни, така и на непрозрачни живи обекти, както и различни функционални процеси в клетките и тъканите в динамика. С помощта на флуоресцентна микроскопия е възможно да се открие и установи локализацията на отделни микроорганизми и вируси.
Например в медицинската микробиология се използват два метода на флуоресцентна микроскопия: методът, използващ флуорохромизация, и методът на белязани антитела с флуорохроми. Методът на флуорохромиране почти не се различава от добре познатите методи за оцветяване със стандартни багрила и изисква по-малко време (части от минута). В бактериологията този метод се използва като метод за луминисцентно откриване на причинителя на туберкулозата, за диагностика на инфекциозни заболявания като дифтерия, гонорея, рецидивираща треска и др.
Фотолуминесценцията е явлението на светене на обекти, което възниква в резултат на поглъщането на светлинна енергия от обект. По някаква причина луминесцентната светлина има по-голяма дължина на вълната от абсорбираната (правилото на Стокс). Следователно е изгодно да се възбуди луминесценция или с ултравиолетови лъчи (m), или за да се наблюдава луминесценция във видимия спектър.
Този тип луминесценция се нарича вторична (индуцирана) за разлика от първичната - собствената флуоресценция, която притежават някои витамини, много пигменти, някои мастни вещества и антибиотици, открити в живите организми, редица продукти на нормалния и патологичен метаболизъм.
Флуорохромите са багрила, които не предизвикват силно оцветяване на обектите при обикновена светлина, но флуоресцират при облъчване с ултравиолетови лъчи. От синтетичните флуорохроми най-добриятрезултатите са акридин оранжево, корифосфин, примулин, родамин, FITC (флуоресцеин изотиоцианат), които обикновено се използват като разредени водни разтвори.
За получаване на възбуждаща светлина, падаща върху обекта, се използва специален източник на светлина, от излъчването на който светлината, възбуждаща луминесценцията, може да бъде отделена чрез система от светлинни филтри.
Има четири групи филтри.
1) Възбуждащите филтри служат за изолиране от общия радиационен поток на светлинния източник онези лъчи, които ще осигурят възбуждане и светене на обекта (монтиран в осветителя на микроскопа).
2) Блокиращият (отрязващ) светлинен филтър не пропуска възбуждаща светлина и пропуска само луминесцентна светлина (монтиран е в оптичната част на самия микроскоп).
3) Сменяеми филтри за различни цели: филтри за защита на очите от проникване на червени и инфрачервени лъчи и топлозащитни филтри. Домашните микроскопи използват стъклени филтри BS8, за да предпазят обектите от избледняване.
4) Разделителят на лъча служи за разделяне на падащия върху обекта светлинен поток (посоката на светлината от източника през лещата към обекта, който възбужда светлината) и светлинния поток, формиращ изображението (луминисцентна светлина
обект). С други думи, разделителят на лъча осигурява необходимото спектрално разделяне на възбуждащата светлина и луминесцентната светлина: той отразява 90% от светлината в спектралната област на възбуждане на луминесценция (400 - 550 nm) и пропуска 90% от светлината в спектралната област на луминесценция на обекта (500 - 700 nm).
Разделителят на лъча е фиксиран в специална вложка, която обикновено има условна маркировка, съответстваща на спектралната област на предаваната светлина, т.е. цвета на луминесценцията на обекта. В домашнифлуоресцентните микроскопи най-често използват три вложки с пластини за разделител на лъча, маркирани: "Зелена", "Зелена - 2" и "Червена". Тези пластини за разделяне на лъчи осигуряват оптимални условия за възбуждане на луминесценция на най-често срещаните флуорохроми в практическата работа: акридиново оранжево,
флуоресцеин изотиоцианат (FITC), родамин и др., които се възбуждат от виолетово,
синя, синя или зелена светлина. Вложката с етикет "Blue" осигурява наблюдение на синя луминесценция, когато се възбужда от ултравиолетово лъчение с дълги вълни с λ max = 365 nm.