Клониране на животни – история на метода
Клониране на животни
История на клонирането
Всички клетки на животинското тяло носят една и съща генетична информация. В процеса на морфогенеза обаче соматичните клетки се диференцират, в резултат на което част от генома се потиска. Колкото по-високо е нивото на специализация на клетките, толкова по-ниска е тяхната тотипотентност. Тази закономерност е установена в експерименти с ядрен трансфер.
За първи път трансплантацията на ядра от соматични клетки на ембриони в енуклеирани клетки на жаба е извършена от американски изследователи Р. Бригс и Т. Кинг през 1952 г. Учените, използвайки микропипета, отстраниха ядрата от яйцата на жабата с нокти и вместо това трансплантираха ядрата на клетки от ембриони на различни етапи на развитие. Проведените изследвания показват, че ядрата на ранните ембриони на етап късна бластула и дори ранна гаструла имат тотипотентност и осигуряват нормалното развитие на ембрионите. Ако ядрата се вземат от клетките на ембриона в ранен стадий на неговото развитие - бластулата, тогава в около 80% от случаите ембрионът се развива безопасно по-нататък и се превръща в нормална попова лъжица. Ако развитието на ембриона, донора на ядрото, е преминало към следващия етап - гаструлата, то само в по-малко от 20% от случаите оперираните яйцеклетки са се развили нормално. Когато се трансплантират ядра от по-диференцирани клетки (мезодерма и средно черво) на късната гаструла, ембрионите показват недоразвитие и дори липса на нервна система. След трансплантацията на ядрото от клетки с по-късно развитие, яйцата изобщо не се развиват.
По-късно Гордън модифицира експеримента. Тъй като повечето от реконструираните яйцеклетки (с ядрото на чревна епителна клетка) умират преди завършването на стадия на гаструла, той се опита да извлече ядра от тях на етапабластула и ги трансплантирайте отново в нови енуклеирани яйцеклетки (тази процедура се нарича "серийна трансплантация" за разлика от "първична трансплантация"). След това броят на ембрионите с нормално развитие се увеличава и те се развиват до по-късни етапи в сравнение с ембрионите, получени в резултат на първичен ядрен трансфер.
Тогава Гердън, заедно с Ласки (1970), започват да култивират in vitro (извън тялото в хранителна среда) клетки от бъбреците, белите дробове и кожата на възрастни животни и да използват тези клетки като ядрени донори. Приблизително 25% от първично реконструираните яйца се развиват до стадия на бластула. При серийни трансплантации те се развиха до стадия на плаваща попова лъжица. По този начин беше показано, че клетките на три различни тъкани на възрастните гръбначни (X. laevis) съдържат ядра, които могат да осигурят развитие поне до стадия на попова лъжица.
На свой ред Di Berardino и Hofner (1983) използват за трансплантация ядрата на неделящи се и напълно диференцирани кръвни клетки - еритроцити на жабата Rana pipiens. След серийна трансплантация на такива ядра, 10% от реконструираните яйца достигат стадия на плаваща попова лъжица. Тези експерименти показаха, че някои соматични клетъчни ядра са в състояние да поддържат пълна потентност.
Причините, поради които ядрата на клетките на възрастни животни и дори късни ембриони остават тотипотентни, все още не са точно установени. Решаваща роля играе взаимодействието между ядрото и цитоплазмата. Веществата, съдържащи се в цитоплазмата на животните, участват в регулирането на експресията на клетъчните гени на ядрото. Възможно е ядрата на диференцираните клетки да не могат да променят асинхронната репликация на ДНК в синхронна, което е характерно за ранните етапи на ембриогенезата. В тази връзка въпросът за възможността за активиране на ген вдиференцираните соматични клетки е от особено значение. Работите на M. di Bernardino и N. Hoffer показват, че цитоплазмата на ооцитите на земноводните съдържа фактори, които възстановяват тотипотентността на ядрата на диференцирани соматични клетки. Тези фактори реактивират потиснатите области на генома.
През 1985 г. е описана технология за клониране на костни риби, разработена от съветски учени Л.А. Слепцова, Н.В. Дабагян и К.Г.Казарян. Ембрионите на етап бластула се отделят от жълтъка. Ядрата на ембрионалните клетки се инжектират в цитоплазмата на неоплодени яйца, които започват да се фрагментират и се развиват в ларви. Тези експерименти показаха, че загубата на тотипотентност от ядрото по време на онтогенезата не е свързана със загубата на гени, а с тяхното потискане. Когато соматичните клетки се култивират in vitro, честотата на ядрената тотипотентност се увеличава. Генетичният механизъм на стабилно потискане на генома на диференцирани клетки не е изяснен, не са разработени методи за възстановяване на тотипотентността, следователно клонирането се извършва главно чрез трансплантация на ембрионални клетъчни ядра.
Ядрените трансплантации при бозайниците започнаха по-късно, през 80-те години на миналия век. Това се дължи на технически трудности, тъй като зиготата на бозайниците е малка. Например, диаметърът на миша зигота е приблизително 60 µm, а диаметърът на оплодената яйцеклетка на жаба е около 1200 µm, т.е. 20 пъти повече. Зиготата на говедата е малко по-голяма от зиготата на мишката, нейният диаметър е 160 μm, но пронуклеусите са скрити от яйчен жълтък, следователно е необходима специална обработка на зиготите преди микроманипулация.
Въпреки тези трудности, първите съобщения за получаване на клонинги на мишки, идентични на донора, се появяват още през 1981 г. Като донор, ембрионални клетки от една от линиите мишки, взети на етапабластоцисти. Надеждността на получените данни първоначално беше поставена под въпрос, тъй като не беше възможно да се възпроизведат резултатите от експериментите, проведени в други лаборатории, но няколко години по-късно J. McGrath и D. Salter също постигнаха успех. В тези експерименти клонове на мишки могат да бъдат получени само ако ядрата на ембрионите са трансплантирани на етап не по-късен от 2 бластомера. Доказано е, че ядрата на 8-клетъчните ембриони и клетките на вътрешната клетъчна маса на бластоциста не осигуряват in vitro развитие на реконструирани яйцеклетки дори до стадия на морула, който предшества стадия на бластоциста. Малка част (5%) от ядрата на 4-клетъчните ембриони позволяват да се развият само до стадия на морула. Тези и много други данни показват, че по време на ембриогенезата при мишки клетъчните ядра губят своята тотипотентност рано, което очевидно е свързано с много ранно активиране на ембрионалния геном, още на 2-клетъчен етап. При други бозайници, по-специално при зайци, овце и говеда, активирането на първата група гени в ембриогенезата става по-късно, на етапа 8-16 клетки. Това може да е причината първият значителен напредък в клонирането на ембриони да бъде постигнат при видове бозайници, различни от мишки. Въпреки това работата с мишки, въпреки трудната им съдба, значително разшири нашето разбиране за методологията за клониране на бозайници.