Космизация на интелигентни молекули, наука и живот
Робърт Кох беше първият ученик в училище, той мечтаеше да стане морски лекар и да обиколи целия свят. Влизайки в университета в Гьотинген, той първо учи в естествения факултет, но бедните му родители убеждават сина му да отиде в медицинския факултет за "хляб". Очакваха го с нетърпение да стане лекар и да печели добри пари.
Уви, дори с докторска степен не беше лесно да се намери място за „хляб“. През 1872 г. Кох става санитарен лекар ("физикус") в град Волщайн (сега Полша). Работата му се ограничаваше до издаване на болнични свидетелства, той установява развитието на епидемии, ваксинира, отваря трупове. Но въпреки че е зает, Робърт Кох създава домашна лаборатория и започва да се занимава с научна работа.
Вместо с газ, той използва газена лампа за нагряване на препаратите. От плочи, пълни с мокър пясък, той изгради нещо като устройство за развъждане на микроби. Върху този пясък той накапва кръвта на заразено животно и наблюдава растежа на бактериална култура. Гледаше с помощта на микроскоп, който купи за рождения си ден - за двадесет и осмия си рожден ден, за сметка на най-строгата икономия на средства. С тази скромна апаратура "бащата на бактериологията" направи редица открития, които удивиха буквално целия свят.
Разгадаването на мистериите на туберкулозата трябва да се счита за венец на научната кариера на учения. В онези дни се смяташе, че една седма от човечеството умира от тази болест. Сега се смята, че около една трета от населението на света е заразено с Mycobacterium tuberculosis.
През 19-ти век туберкулозата се нарича "туберкулоза". При хора и животни, заразени с това заболяване, в засегнатия орган са открити туберкули. Те се състоят от разпадане на жива тъкан, гной. Явно в тях седяха микроби, които по никакъв начин не можеха да бъдат открити. Кох се зае с този бизнес, след като получивече със значителна слава, той се премества в Берлин, където има собствена добре оборудвана лаборатория, от която не излиза от сутрин до късно през нощта. Той изрязва парчета от заразени органи на хора, починали от туберкулоза, и внимателно ги изследва.
Отне години упорита работа, за да покажем на света туберкулозните микроби от първа ръка. Това не бяха дебелите, големи, лесно видими пръчици на антракса, които Кох беше изследвал преди това. Това бяха тънки линии, едва различими дори под добър микроскоп, които бяха наречени "пръчици на Кох".
Революция в бактериологията
За да изследвате невидими същества (микроби), трябва да можете да ги видите. Също така е необходимо да се гарантира, че това е правилната бактерия, а не случайно обърната под ръката.
Преди Кох бактериите са се отглеждали в течни хранителни среди, главно в бульон. Ясно е, че когато бяха поставени в тези течни среди, нямаше гаранция, че външни микроби няма веднага да растат наблизо. Трябваше - и то повече от веднъж! - повтаряйте и повтаряйте същите операции, за да стигнете до правилните бактерии. От мястото, където се концентрираха най-много, те взеха малка капчица, прехвърлиха я в друга епруветка с бульон и отгледаха тази колония там. За съжаление се оказа, че и тук има странични микроби, макар и в по-малък брой. Отново се взема капка от изследваните микроорганизми, прехвърля се в трета епруветка - и така нататък, докато накрая се получи повече или по-малко чиста култура, без чужди примеси.
Един ден Кох случайно забеляза, че варените картофи, нарязани наполовина, след като дълго време лежаха на лабораторната маса, бяха покрити с многоцветни точки: зелени, кафяви, червени. Ученият се интересуваше от това, което видя. Изваден с платинена игламалки парчета от тези многоцветни точки и започнаха да изследват под микроскоп. Оказа се, че всяка точка е колония от бактерии, които са се развили на повърхността на картофа. Разни бактерии! Кох моментално осъзна какво голямо откритие е направил. Той намери солидна хранителна среда!
Въвеждането на твърдите хранителни среди от Кох беше революция в бактериологичната технология. През 1881 г. той публикува Методи за изследване на патогенните организми, в които описва методи за отглеждане на микроби върху твърди хранителни среди. С тяхна помощ ученият успява, използвайки подходящи багрила (магента, анилинови багрила), да открие малки, леко извити, яркосини пръчици, сега известни като пръчици на Кох, в смачканата туберкулозна тъкан на пациента.
Сега бактериалните (както и вирусните) колонии се отглеждат не само в течност, но и върху твърда хранителна среда, приготвена върху агар или желатин. Всяка колония е потомство на една бактериална клетка, локализирана на мястото, където тази родителска клетка е била "засята". Методът на Кох позволява да се идентифицира причинителя на инфекцията по вида и свойствата на образуваните колонии, а също така дава възможност за директно преброяване на техния брой. Всичко това прави микробиологичния анализ по-лесен, по-бърз и по-евтин, а резултатът е по-точен. При достатъчно разреждане на инокулума колониите се разделят пространствено. И отделните клетки не си пречат да се размножават. Следователно е възможно да се определи желаната бактерия дори когато се изследват сложни смеси от микроорганизми, в които желаният инфекциозен агент присъства в следи от количества или е неконкурентоспособен по отношение на други бързо растящи микробни видове.
Метод на молекулярни колонии
Роберт Кох даде примердостоен за всякакви имитации. В края на 20 век по този път са минали и български (тогава съветски) учени, служители на Института за белтък на Българската академия на науките (ИБ РАН) в град Пущино на Ока, намиращ се на около стотина километра от Москва, в края на 20 век.
През 1985 г. в Института по биохимия на Руската академия на науките е създадена научна група, която през 1998 г. е преобразувана в Лаборатория по биохимия на вирусна РНК под ръководството на Александър Четверин, сега доктор на биологичните науки, член-кореспондент на Руската академия на науките.
Целта на създаването на групата на Четверин е разработването на методи за ефективно извънклетъчно възпроизвеждане на РНК молекули. Възпроизвеждането (клонирането) на РНК и ДНК молекулите може да е необходимо за генетични, имунологични и други молекулярно-биологични изследвания; в медицината - за диагностика на много заболявания: от вирусни до онкологични. По дългия път към постигането на тази цел са направени редица важни открития и изобретения. Включително е изобретен методът на молекулярните колонии (ако е съкратено MMC).
Особеността на тази научна новост е, че молекулите, които носят наследствена информация, РНК и ДНК, не се размножават в течност, както обикновено е обичайно, а в специална среда - гел. Поради това потомството на всяка молекула образува колония и не се разпространява в течността в целия обем.
По този начин една молекула може да бъде умножена до откриваем брой идентични молекули, което прави възможно откриването, идентифицирането и преброяването на единични молекули. В крайна сметка всяка колония е молекулярен клонинг (много копия на молекулата, първоначално поставени в дадена точка в гела). А броят на колониите показва броя на ДНК или РНК молекулите, които са в гела преди началото на реакцията.
Но успехът на Пушкинската група не дойде веднага. Препятствията, които стояха на пътя на изследователите, бяха доста сериозни. Нека сравнимнапример размерите на обектите на изследване на Кох и групата Четверин. Бактериите - най-често едноклетъчни прокариотни (безядрени) микроорганизми - имат микронни размери (1 микрон = 10 -4 сантиметра), докато ДНК или РНК молекулите са наномолекули (1 нанометър = 10 -7 сантиметра), т.е. те са с няколко порядъка по-малки от бактериите.
Освен това, ако бактериите и вирусите са създания на доста сложна, но все пак интегрална, може дори да се каже, автономна, самодостатъчна организация, тогава ДНК и РНК са само детайли (макар и важни) на жива клетка, които трябваше да бъдат изолирани от клетката (изолирани) и размножени. Такива отделни изолирани макромолекули са много по-уязвими вещества от бактериите.
Точно както тялото е изградено от отделни органи, клетката се състои от много части, отговорни за храненето, възпроизводството и изхвърлянето на отпадъците. Многобройни съставни части, компоненти на живата клетка. Съдържа ядрото, нуклеола, митохондриите (в животинските клетки), хлоропластите (в растенията), лизозомите, апарата на Голджи, вакуоли, центриоли и т.н. Плюс външни и вътрешни мембрани, които разделят клетката на отделни отделения, в които тя създава свои собствени протеини, мазнини, въглехидрати ... Това е гениалното био-царство, където обичайно живеят ДНК и РНК наследствени молекули.
Биолозите трябваше не само да извлекат тези молекули от клетката, но най-важното, да създадат изкуствена среда за тях. Каква аналогия веднага идва на ум? Разбира се, човек, който овладява враждебно пространство (безтегловност, липса на атмосфера, нулево налягане). Със своите скафандри, орбитални станции с храна, вода, всякакви животоподдържащи системи, всичко, което имитира пълноценен човешки живот на Земята. Така Четверин и неговият екип трябвашеда извърши нещо като "космизация" на ДНК и РНК молекули.
Учените са избрали полимеразната верижна реакция (PCR) като основна система за възпроизвеждане на молекули. Този метод се използва широко в биологията и медицината. Но за разлика от традиционния PCR, който се извършва в течност, изследователите от Института за протеини решават да извършат реакцията в специално подготвена пореста гелообразна маса.
Сега - подробностите. Вече отбелязахме, че РНК и ДНК са наномолекули. Оказва се, че матрицата (основното вещество) на гела образува триизмерна мрежа с размери на порите също в нанометровия диапазон. Това обстоятелство дава възможност колониите на Четверин да се наричат наномолекулни колонии или просто наноколонии.
Използването на имобилизирана среда е ключов момент: гелната матрица предотвратява конвекцията на средата и предотвратява дифузията на наномолекулите. Следователно, потомството на оригиналната молекула е концентрирано в ограничена област около родителската молекула. В същото време самата матрична мрежа не засяга дифузията на по-малки молекули - всичко, което е необходимо за възпроизвеждането на ДНК и РНК молекулите, за доставката на всички реакционни субстрати към тях.
В очакване на нови тестови системи
Методът на молекулярната колония може да се използва в много области: за ултрачувствителна диагностика на вируси и рак, както и за извънклетъчно клониране и генен скрининг, до идентифициране на гени чрез функцията на кодирани протеини.
Разработените от групата на Четверин тестове гарантират доста бърз резултат. Изолирането на нуклеинови киселини от кръвна проба отнема от половин час до няколко часа, след което са необходими още около два часа за самата реакция.
Служителите на Института за протеини вече са използвали своя метод за диагностициране на редица инфекциозни заболявания, по-специално например за РНК на вируса на СПИН и ДНК на вируса на хепатит В. Експериментално е доказано, че чувствителността на новия метод е много по-висока от тази на старите методи, базирани на размножаване на РНК или ДНК в течност.
Лабораторията по биохимия на вирусна РНК работи и по диагностика на онкологични заболявания. Изследователите искат да диагностицират рак чрез откриване на РНК молекули в клинични кръвни проби, които присъстват във всички ракови клетки без изключение. Пример за такъв универсален маркер е информационната РНК (иРНК) на теломеразния протеин, ензим, отговорен за синтеза на крайните участъци на хромозомите (теломерите). Същата иРНК се намира и в нормалните стволови клетки, които подобно на раковите клетки имат способността да се делят неограничено. Последните обаче са в своите ниши и не се разпространяват в тялото. По този начин наличието на иРНК на теломераза там, където не трябва да има стволови клетки (например в кръвната плазма), може недвусмислено да показва наличието на злокачествен процес в организма. Александър Четверин смята, че ако има всички необходими контролни изследвания, ще може да се каже със сигурност дали човек има рак или не.
Разработената техника е универсална и може да бъде полезна не само в медицината. Използването на наноколонии може да бъде много полезно за различни области на биотехнологиите, селското стопанство, криминалистиката, мониторинга на околната среда, фундаменталната наука и накрая. Това може да бъде химия на единични молекули, безклетъчно клониране и генен скрининг, секвениране, молекулярна диагностика... Методът на молекулярната колония (MCM), или просто методът на наноколонията (MN), неизбежно ще се превърне в развита технология с течение на времето с уникални възможности и висок потенциал за решаване на научни и приложни проблеми.
Възпроизвеждане на ДНК в клетката
МолекулаДНК се самовъзпроизвежда (копира) с всяко делене на клетката. В този случай слабите връзки между двете вериги на двойната спирала на ДНК се разрушават, в резултат на което веригите се разделят. След това върху всяка от тях се изгражда втора ДНК верига, комплементарна на първата. В резултат на това, когато една клетка се дели, оригиналната ДНК молекула се дублира, така че и двете клетки имат едно пълно копие на ДНК. Този процес се нарича репликация. Така че генетичната информация, съдържаща се в ДНК, се запазва напълно по време на клетъчното делене.