Метод за хистологична оценка на степента на зрялост на месото
Собственици на патент RU 2604138:
Изобретението се отнася до областта на приложната биотехнология. Методът за хистологична оценка на степента на узряване на месото се състои във фиксиране на проби във формалин, получаване на микроскопични препарати и оценката им според структурата на миофибрилите. Пробата се приготвя чрез алкална дисоциация на мускулни парчета с размери 0,3 * 0,3 * 0,3 cm в 40-50% разтвор на КОН за 18-24 часа след фиксирането им в 10% воден разтвор на формалин за 12-24 часа, прехвърля се в дестилирана вода и се съхранява в хладилник за 40-50 часа. Мускулните влакна се разделят чрез разклащане, приготвят се петна и се оцветяват с оценка на структурата на миофибрилите. На първия етап от узряването на месото намазките показват нарушения на целостта на отделните мускулни влакна при запазване на ядра и набраздяване. На втория етап намазките разкриват нарушения на целостта на много мускулни влакна при запазване на ядра и набраздяване. Третият етап се характеризира с разпадането на отделни фрагменти в миофибрили, ядра и набраздяване не се откриват. Изобретението осигурява повишаване на точността на оценката и улесняване на подготовката на пробите.
Изобретението се отнася до областта на приложната биотехнология, по-специално до метод за хистологична оценка на степента на узряване на месо от всички видове животни за клане и птици и може да се използва за определяне на автолитични промени в месото.
Недостатъците на тези методи са, че определянето на един показател не дава пълна картина на автолизата и не може да служи като достатъчен критерий за степента на узряване на месото. За извършване на комплекс от методи, достатъчни за обективна оценка, са необходими скъпи реактиви, необходима е трудоемка подготовка на пробите, свързана със смилането и екстракцията. В резултат на смесването получаваме средна представа замускулни промени.
В сравнение с тези методи хистологичното изследване на месото е по-надеждно и ясно. В допълнение, оценката на микроструктурните показатели на месото също позволява да се определи неговата пригодност за съхранение и транспортиране, разумно да се вземе решение относно времето за неговото прилагане и рационално използване, да се определи фалшификацията и степента на добро качество в случай на разногласия в санитарната оценка, за да се предотврати загубата на ценен протеинов продукт (Морфологични изследвания във ветеринарните лаборатории: Методическо ръководство. Москва: Министерство на земеделието на Руската федерация, Ветеринарна служба медицина, 2003. С. 69-70).
Недостатъкът на този метод е необходимостта от получаване на хистологични срезове с помощта на скъпо устройство - микротом за замразяване, ниското качество на получените срезове (дебелина над 15 μm, лошо запазване на мускулната структура), сложността на хистологичната оценка на структурата на мускулните влакна в получените срезове и недостатъчната точност на получените резултати поради разрушаването на мускулните влакна при изрязването им на микротом.
Целта на изобретението е да се разработи метод за хистологична оценка на степента на узряване на месото, с висока точност на резултатите и лекота на обработка на пробите без използване на замразяващ микротом. В този случай дебелината на намазките ще бъде равна на дебелината на мускулните влакна. Последните ще бъдат запазени по цялата им дължина, което е идеално за оценка на микроструктурата.
Техническият резултат, който може да бъде получен с помощта на настоящото изобретение, е да се подобри точността на оценката и лекотата на обработка на пробата.
Техническият резултат се постига с помощта на метод за хистологична оценка на степента на зрялост на месото, включващ приготвяне на проба и нейното изследване.Освен това пробата се приготвя чрез алкална дисоциация на мускулни парчета, фиксирани във формалин, отделяне на мускулни влакна чрез разклащане, правене на петна и оцветяването им с хистологични багрила, последвано от оценка на степента на узряване на месото чрез микроструктурата на миофибрилите. В същото време се извършва фиксиране на мускулни парчета с размери 0,3 * 0,3 * 0,3 cm в 10% воден разтвор на формалин за 12-24 часа. След това парчетата се инкубират в 40-50% алкален разтвор на КОН за 18-24 часа, прехвърлят се в голям обем дестилирана вода и се съхраняват в хладилник за 40-50 часа. Суспензията от мускулни влакна, получена в резултат на алкална дисоциация, се излива в петриево блюдо и енергично се разклаща, за да се разделят накрая мускулите на отделни влакна, от които се приготвят петна, изсушават се на въздух и след оцветяване с хистологични багрила се оценяват целостта на мускулните влакна, тяхната фрагментация, запазването на клетъчните ядра, наличието на напречна и надлъжна ивица.
Първият етап на узряване на месото се характеризира с факта, че намазките показват нарушения на целостта на напречни прорези или фрагментация на отделни мускулни влакна, като същевременно се запазва структурата на ядрата, напречната и надлъжната набразденост във фрагментите. Вторият етап на узряване на месото е различен по това, че намазките показват множество нарушения на целостта, подобни на напречни процепи, или фрагментация на много мускулни влакна, като същевременно се запазва структурата на ядрата, напречната и надлъжната набразденост във фрагментите. Третият етап на узряване на месото се характеризира с разпадането на отделни фрагменти в миофибрили, а миофибрилите в саркомери под формата на гранулирана маса, затворена в ендомизий. Ядрата, напречната и надлъжната набразденост практически не се откриват.
Пример за конкретно изпълнение на метода за хистологична оценкастепента на зреене на месото.
Изследвани са автолитичните промени в мускулите на пуйки, кокошки носачки, коне и говеда. Изследвахме промените в хистоструктурата по време на охлаждане и съхранение на месо. За хистологично изследване се вземат проби на редовни интервали. Проби с размери 0,3*0,3*0,3 cm се фиксират в 10% воден разтвор на формалин за 12-24 часа. След това парчетата се инкубират в 40-50% алкален разтвор на КОН за 18-24 часа, прехвърлят се в голям обем дестилирана вода и се съхраняват в хладилник за 40-50 часа. Суспензията от мускулни влакна, получена в резултат на алкална дисоциация, се излива в петриево блюдо и се разклаща енергично, за да се разделят накрая мускулите на отделни влакна, от които се приготвят намазки и се сушат на въздух. След оцветяване на петна с хематоксилин и еозин се оценява целостта на мускулните влакна, тяхната фрагментация, запазването на клетъчните ядра и наличието на напречна и надлъжна ивица.
При пуйки, 15 минути след клането, мускулните влакна са в отпуснато състояние. Те са прави, дори с ясно изразена напречна ивица. Мускулните влакна на гръдния мускул са с по-голям диаметър в сравнение с бедрения мускул. След 2 часа мускулните влакна набъбват, което се потвърждава от увеличаването на техния диаметър. Напречната набразденост в някои области е запазена и е най-силно изразена в бедрения мускул. Изчезването на напречната набразденост на мускулните влакна е характерна черта на развиващата се автолиза. След 4 часа съхранение мускулните влакна се сгъстяват, границите им стават по-малко ясни. Повечето от мускулните влакна на гръдния мускул придобиват фина вълнообразна конфигурация. Ядрата имат размита форма. Това означава, че в гръдния мускул протича по-интензивна гликолиза. Припоследващо съхранение (6 часа) формата на мускулните влакна на гръдния мускул приема формата на извита вълнообразна линия. Мускулните влакна в пробата от бедрен мускул имат области на хомогенизиране. По време на узряването на месото (8 часа) се забелязват хомогенизирани участъци в гръдния мускул, удебеляване и свиване на мускулни влакна, с които ендомизиумът се слива в бедрения мускул. Това е показател за мускулна скованост. Съхранението на месо за 10 часа води до подуване на мускулните влакна, границите между тях са неясни. След 12 часа дебелината на мускулните влакна намалява, което е свързано с разпадането на актиномиозиновия комплекс и разрешаването на rigor mortis. 24 часа след клането в пробите се отбелязва разрушаването на миофибрилите в отделни саркомери под формата на гранулирана маса, отбелязват се разкъсвания и пукнатини. Такива структурни промени обикновено се случват на етапа на узряване на месото, когато мекотата се увеличава, вкусът и ароматът на месото се подобряват.
В резултат на изследване на диаметъра на мускулните влакна в пуешкото месо е установено, че най-високите им стойности са по време на периода на максимална мускулна скованост: след 6 часа - за гръдния мускул и 8 часа - за бедрения мускул. Така в резултат на експериментални изследвания беше установено, че пуешкото месо се различава от другите видове птиче месо по скоростта на автолитичните процеси. При идентичния характер на автолитичните промени в гръдните мускули, в сравнение с бедрените мускули, има по-ранна и по-дълбока гликолиза, което се отразява на качеството на месото. Идентифицираните характеристики на автолизата показват необходимостта от диференциран подход към възможното време за използване на отделни части от трупа на пуйка при производството на месни продукти.
При кокошките носачки 30 минути след клането се наблюдава преход от постмортална релаксация към rigor mortis в гръдните мускули. След 1 часима намаляване на дължината на саркомерите, т.е. до преход към по-изразена и широко разпространена контракция на актиномиозиновия комплекс. 2 часа след клането в гръдните мускули на пилетата настъпва комплекс от структурни промени, характерни за rigor mortis. В бедрените мускули по това време се наблюдава увеличаване на проявите на rigor mortis със свиване и скъсяване на саркомерите. 4 часа след клането влакната на гръдните мускули на пилетата имат предимно изправена форма. По този начин използването на месо от кокошки носачки е възможно вече 4-6 часа след клането, т.к до този момент rigor mortis е завършен и в бъдеще ще настъпи узряване на месото.
В двойното конско месо мускулните влакна са в отпуснато състояние: те се подуват с ясно изразени напречни ивици, докато надлъжните ивици са изгладени. Ядрата имат удължена пръчковидна и зърнесто-бучка структура на хроматина. 8 часа след клането повечето мускулни влакна стават прави или придобиват леко забележима вълнообразна конфигурация. След 24 часа съхранение конфигурацията на мускулните влакна придобива извити очертания, напречната набразденост се запазва само в четириглавия бедрен мускул. Това означава, че по-интензивна гликолиза настъпва в longissimus dorsi мускул. На 2-ия ден от съхранението мускулните влакна на четириглавия бедрен мускул придобиват вълнообразна конфигурация. На 4-ия ден след клането мускулните влакна набъбват, напречната ивица се изглажда и се появява надлъжна фибрилация. Ядрата стават овални, структурата на хроматина е ясно определена. На 7-ия ден от съхранението напречната и надлъжната ивица става невидима, ядрата са размити и структурата на хроматина не се вижда в тях. При някои влакна, разграждането на саркомерите дозърнеста маса. На 10-ия ден от съхранение мускулните влакна се подуват, целостта им се нарушава или се появява фрагментация със запазване на структурата на ядрата. Такива дълбоки промени в структурата се отбелязват на етапа на узряване на месото, когато мекотата се увеличава, ароматът и вкусът на месото се подобряват.
Установено е, че хистологичните промени, настъпващи в мускулната тъкан на конете, са подобни на тези, настъпващи в говеждото, но има разлики във времето за достигане на определен етап на автолиза на различните мускули. В мускулната тъкан на говеждото месо етапът на rigor mortis започва след 18-24 часа и продължава до 2-3 дни, а същинското узряване на месото започва още на 6-ия ден. Такива различия са свързани с различна двигателна активност на животните.
Методът за хистологична оценка на степента на узряване на месото ви позволява точно, бързо, без трудоемка обработка на проби, да определите промените в мускулните влакна, включително с помощта на количествени морфометрични методи, и на тази основа да установите етапите на узряване на месото. Настоящото изобретение в сравнение с прототипа и други технически решения има следните предимства: висока точност при оценка на степента на узряване на месото, лекота на изпълнение без необходимост от получаване на хистологични срезове с помощта на скъпо устройство - микротом за замразяване.
Методът за хистологична оценка на степента на узряване на месото се състои във вземане на проби, фиксирането им във формалин, получаване на микроскопични препарати и оценката им по структурата на миофибрилите, характеризиращ се с това, че фиксирането на мускулни парчета с размери 0,3 * 0,3 * 0,3 cm се извършва в 10% воден разтвор на формалин за 12-24 часа, след което парчетата се инкубират в 40- 50% KOH алкален разтвор за 18-24 часа, прехвърлен в голям обем дестилирана вода исъхранява се в хладилник за 40-50 часа, получената суспензия от мускулни влакна се излива в петриево блюдо и се разклаща енергично, за да се отделят накрая влакната, от които се приготвят намазки, изсушават се на въздух, оцветяват се с хистологични багрила и се оценява целостта на мускулните влакна и тяхната фрагментация; на първия етап от узряването на месото, намазките показват нарушения на целостта на напречни процепи или фрагментация на отделни мускулни влакна, като същевременно се запазва структурата на ядрата, напречната и надлъжната ивица в фрагментите; на втория етап на узряване на месото, намазките разкриват множество нарушения на целостта, подобни на напречни процепи, или фрагментация на много мускулни влакна, като същевременно се запазва структурата на ядрата, напречната и надлъжната ивица в фрагментите; третият етап на узряване на месото се характеризира с разпадането на отделни фрагменти в миофибрили и миофибрили в саркомери под формата на гранулирана маса, затворена в ендомизий, докато ядрата, напречната и надлъжната ивица практически не се откриват.