Микроскопия – контрастни методи, Диаем
1. Светлинно поле
Методът на светлото поле в пропускащата светлина се използва при изследване на прозрачни препарати, в които различни части от структурата абсорбират светлината по различен начин (тънки цветни срезове от животински и растителни тъкани, тънки срезове от минерали и др.). Лъчът от осветителната система преминава през образеца и лещата и създава равномерно осветено поле в равнината на изображението. Структурните елементи на лекарството частично абсорбират и отклоняват падащата върху тях светлина, което причинява появата на изображението.
Методът може да бъде полезен и при наблюдение на непоглъщащи обекти, но само ако те разпръскват светещия лъч толкова силно, че значителна част от него не попада в обектива. Методът на яркото поле при отразена светлина се използва за наблюдение на непрозрачни обекти, като гравирани участъци от метали, биологични тъкани и различни минерали. Препаратът е осветен отгоре, чрез леща, която едновременно изпълнява ролята на осветителна система. Изображението, както и при преминаващата светлина, се създава поради факта, че различните части на препарата неравномерно отклоняват падащата върху тях светлина, а отразените лъчи имат различен интензитет.
2. Тъмно поле
Микроскопията в тъмно поле се основава на способността на микроорганизмите силно да разпръскват светлина. За микроскопия в тъмно поле се използват обикновени обективи и специални кондензатори в тъмно поле. Основната характеристика на кондензаторите с тъмно поле е, че централната им част е затъмнена и директните лъчи от осветителя не попадат в обектива на микроскопа. Обектът се осветява от наклонени странични лъчи, като в обектива на микроскопа влизат само лъчи, разпръснати от частици в препарата.Микроскопията с тъмно поле се основава на ефекта на Тиндал, добре известен пример за който е откриването на прахови частици във въздуха, когато са осветени от тесен лъч слънчева светлина. За да предотвратите навлизането на директна светлина от осветителя в обектива, отворът на обектива трябва да е по-малък от отвора на кондензатора. За да се намали диафрагмата, в конвенционален обектив се поставя диафрагма или се използват специални лещи, оборудвани с ирисова диафрагма. При микроскопия в тъмно поле микроорганизмите изглеждат ярко светещи на черен фон. С този метод на микроскопия могат да бъдат открити най-малките микроорганизми, чиито размери са извън разделителната способност на микроскопа. Микроскопията с тъмно поле обаче ви позволява да видите само контурите на обекта, но не ви позволява да изучавате вътрешната структура. С помощта на микроскопия в тъмно поле се изследват препарати от типа на смачкани "капки". Предметните стъкла трябва да са с дебелина не повече от 1,1-1,2 mm, покривните 0,17 mm, без драскотини и замърсявания. При приготвянето на препарата трябва да се избягва наличието на мехурчета и големи частици (тези дефекти ще се виждат ярко светещи и няма да позволяват наблюдение на препарата). За тъмно поле се използват по-мощни осветители и максималното нажежаване на лампата. Настройката на осветлението в тъмното поле е основно както следва: 1) настройте светлината на Koehler; 2) заменете кондензатора със светло поле с такъв с тъмно поле; 3) масло за потапяне или дестилирана вода се нанася върху горната леща на кондензатора; 4) повдигнете кондензатора, докато влезе в контакт с долната повърхност на предметното стъкло; 5) лещата с ниско увеличение е фокусирана върху препарата; 6) с помощта на центриращи винтове светло петно се прехвърля в центъра на зрителното поле (понякога със затъмнена централна зона); 7) чрез повдигане и спускане на кондензатора, изчезването назатъмнена централна зона и получаване на равномерно осветено светлинно петно. Ако това не успее, трябва да се провери дебелината на слайда (това явление обикновено се наблюдава, когато се използват твърде дебели слайдове - светлинният конус е фокусиран в дебелината на слайда). След като регулирате правилно светлината, задайте желаното увеличение на лещата и прегледайте препарата.
3. Поляризация
Методът за изследване в поляризирани лъчи се използва в пропусната и отразена светлина за така наречените анизотропни обекти, които имат двоен лъч на пречупване или отражение. Такива обекти са много минерали, въглища, някои животински и растителни тъкани и клетки, изкуствени и естествени влакна. При изследване на анизотропни препарати към обичайната схема на микроскопа пред осветителната система се добавя поляризатор, а след лещите, които са в кръстосано или успоредно положение една спрямо друга, се добавя анализатор. Когато поляризаторът и анализаторът са кръстосани, тъмните, ярките или цветните анизотропни елементи на обекта се виждат в тъмното зрително поле на микроскопа. Формата на тези елементи зависи от положението на обекта спрямо равнината на поляризация и от големината на двойното пречупване. По-точното определяне на оптичните данни на обекта се извършва с помощта на различни компенсатори (неподвижни кристални плочи, подвижни клинове и плочи).
4. Фазов контраст
При микроскопиране на неоцветени микроорганизми, които се различават от околната среда само по индекса на пречупване, няма промяна в интензитета (амплитудата) на светлината, а се променя само фазата на предаваните светлинни вълни. Следователно окото не може да забележи тези промени и наблюдаваните обекти изглеждат слабоконтрастни, прозрачни. За наблюдение на такива обекти се използва фазово-контрастна микроскопия, базирана на трансформацията на невидимите фазови промени, въведени от обекта, в амплитудни промени, които са видими за окото. Устройството за фазов контраст може да се инсталира на всеки светлинен микроскоп и се състои от: 1) набор от обективи със специални фазови пластини; 2) кондензатор с въртящ се диск. Той има пръстеновидни диафрагми, съответстващи на фазовите пластини във всяка от лещите; 3) допълнителен телескоп за регулиране на фазовия контраст. Регулирането на фазовия контраст е както следва: 1) сменете лещите и кондензатора на микроскопа с фазови (обозначени с буквите Ph); 2) Прикрепете обектив с ниско увеличение. Отворът в диска на кондензатора трябва да е без пръстеновидна диафрагма (маркирана с цифрата "0"); 3) регулирайте светлината според Koehler; 4) изберете фазова леща с подходящо увеличение и я фокусирайте върху образеца; 5) завъртете кондензаторния диск и настройте пръстеновидната диафрагма, съответстваща на лещата; 6) извадете окуляра от тръбата и поставете допълнителния телескоп на мястото му. Регулирайте го така, че фазовата пластина (под формата на тъмен пръстен) и пръстеновидната диафрагма (под формата на светъл пръстен със същия диаметър) да са ясно видими. С помощта на регулиращите винтове на кондензатора тези пръстени се подравняват. Извадете допълнителния телескоп и поставете отново окуляра. Чрез използването на този метод на микроскопия контрастът на живите неоцветени микроорганизми се увеличава драстично и те изглеждат тъмни на светъл фон (положителен фазов контраст) или светли на тъмен фон (отрицателен фазов контраст). Фазово-контрастната микроскопия се използва и за изследване на клетки от тъканна култура, за да се наблюдава ефекта на различни вируси върхуклетки и др. В тези случаи често се използват биологични микроскопи с обратно разположение на оптиката - инвертирани микроскопи. В такива микроскопи обективите са разположени отдолу, а кондензаторът е отгоре.
5. Флуоресценция (луминисценция)
6. Контраст на Хофман Контрастът на Хофман (HC) е техника за наклонено осветяване, която подобрява контраста в оцветени и неоцветени слайдове чрез генериране на оптичен фазов градиент. XK ви позволява да наблюдавате триизмерно изображение на живи проби в пластмасови чинии с висока яснота, което предоставя разширени възможности за решаване на научни и специални медицински проблеми. Благодарение на използването на големи работни разстояния и големи числови апертури, методът дава възможност за точно проследяване на движението в зрителното поле, например при извършване на микроманипулации.
Други изследвания - като електрофизиология, асистирани репродуктивни технологии и IVF - изискват не само кондензатори, но и лещи с голямо работно разстояние. При изследване на дебели проби, CC помага да се реши проблемът с послойното изследване на пробата, като се избира последователността на фокалните равнини. В същото време всеки горен фокусен план не носи информация за основния план. XC може да се използва на микроскоп с флуоресцентна светлина. Изследването на морфологията със или без използването на флуоресценция е възможно без смяна на лещи и проби. Струва си да се отбележи предимството на контраста на Хофман пред фазовия контраст. Известно е, че фазовият контраст е присъщ на Halo ефекта - появата на светещ ореол по контура на изображението на обекта. В резултат на това може да загубите важна информация. XK не предоставя Halo, което улеснява определянето на свойствата на ръбовите структури, например точно измерване на ъгли или разстояния.
7. DIC (диференциален интерферентен контраст)
DIC (Differential Interference Contrast) е отличен механизъм за създаване на контраст в прозрачни препарати. DIC микроскопията е интерферентна система за разделяне на лъча, при която референтният лъч се отклонява на малко разстояние, обикновено по-малко от диаметъра на дифракционния кръг. Този метод създава монохроматично засенчено изображение, което показва градиента на оптичните пътища както на високите, така и на ниските пространствени честоти, присъстващи в образеца. Тези участъци от препарата, при преминаване през които оптичните пътища се удължават спрямо контролния лъч, изглеждат по-светли или по-тъмни, докато участъците, между които има по-малко разлики, имат противоположен контраст. Колкото по-стръмен става градиентът на оптичния лъч, толкова по-остър е контрастът на изображението
