Молекулярни основи на действието на фитохормоните
Постиженията в молекулярната биология и генетиката позволиха нов подход към изучаването на механизма на действие на хормоните. Модифицираните растения, както мутантни, така и трансгенни, са широко използвани. Особено голям напредък е постигнат в изучаването на рецепцията и трансдукцията на хормони, както и тяхното взаимодействие на транскрипционно ниво. Повечето учени смятат, че подобно на животинските хормони, първичната реакция на фитохормоните е да взаимодействат с рецептора.
Рецепторите са протеинови молекули, които разпознават хормон, специфично се свързват с него, променяйки конфигурацията си, за да образуват комплекс хормон-рецептор. Комплексът хормон-рецептор предава хормоналния сигнал, необходим за „задействане“ на физиологичния отговор на клетката. Рецепторите са разположени както върху мембраните, така и в цитозола. Един и същи хормон може да се свърже с различни рецептори, като по този начин предизвиква различни физиологични реакции. Това е една от причините за мултифункционалността в действието на фитохормоните. Трябва да се има предвид, че фитохормоните засягат само податливите към тях (компетентни) клетки. Едно от най-важните условия за компетентност е наличието на специфични рецептори. Генетичен подход е успешно използван за идентифициране на рецепторни протеини. Обектът на най-много изследвания е малко растение от семейството. Кръстоцветни Arabidopsis thaliana - Arabidopsis (резец на Тал). Това се дължи на бързото възпроизвеждане на това растение, кратък жизнен цикъл (около 6 седмици) и изследване на неговия геном. Използват се обаче мутанти и трансгенни индивиди от растения като царевица, тютюн, соя и домати. Трудността на тези изследвания се състои в това, че по правило фитохормоните се свързват с многопротеини, но не всички от тях имат рецепторни функции, т.е. участват в по-нататъшното предаване на хормоналния сигнал. Първият протеин с рецепторна функция е открит за ауксини, ABP1, ауксин-свързващ протеин.
Предполага се, че този протеин е свързан с хормона чрез метален йон. ABP1 е локализиран върху ендоплазмения ретикулум и частично върху плазмалемата. Това е частта от протеина, която се намира върху плазмалемата, която служи за възприемане на ауксиновия сигнал. Протеинът, намиращ се в спешното отделение, е резервен. Свързването на ауксин с рецептора е последвано от активиране на група транскрипционни фактори, включени в сигналната верига. Това индуцира транскрипцията на ранните гени (гени за първичен отговор). Инхибиторите на протеиновия синтез като циклохексимид не инхибират експресията на ранните гени. Времето за експресия на ранните гени е ограничено и варира от няколко минути до един час. Изследвания на животински хормони показват, че гените с директен отговор изпълняват няколко задачи, включително кодиране на протеини, които регулират транскрипцията на гени за вторичен отговор (късни гени). През 1996 г. Abel et al идентифицират 5 групи ранни ауксинозависими гени. Гените от първата група кодират образуването на малки полипептидни вериги с молекулно тегло 19-36 kDa. Тези вериги са краткотрайни фактори за регулиране на транскрипцията и служат като репресори или активатори за експресията на късни гени. Късните гени кодират протеини, които предизвикват физиологичен отговор. Например, в случая на ауксин, транскрипционен регулаторен фактор индуцира експресията на късен ген, който кодира протеази и рибонуклеази, участващи в клетъчната диференциация и образуването на ксилемни елементи. Търсенето на цитокининови рецептори се извършва от няколко години в различни лаборатории. МембранаЦитокининовият рецептор е изолиран през 2001 г. Това е предшествано от откриването на нечувствителни към цитокинини мутанти на Arabidopsis. Бяха изолирани съответният ген и рецепторният протеин, кодиран от този ген. Този рецептор е локализиран в плазмалемата. Предполага се, че принадлежи към класа на двукомпонентните контролери. Един домен на този рецепторен протеин, разположен от външната страна на мембраната, разпознава и свързва цитокинина. Свързването води до фосфорилиране и като следствие до промяна в конфигурацията и активиране на рецептора. След това се включва сигнална верига, представляваща каскада на фосфорилиране, в края на която фосфатът се прехвърля към факторите за регулиране на генната транскрипция. Досега в Arabidopsis са идентифицирани седем гена за първичен отговор към цитокинините. Трябва да се отбележи, че има данни за регулирането на протеиновия синтез от цитокинини не само на нивото на транскрипция, но и по независим от транскрипцията начин (O.N. Kulaeva, V.V. Kuznetsov). Това може да се случи поради регулирането на фосфорилирането на рибозомни протеини и протеинови транслационни фактори от цитокинини.
Етиленовите рецептори са структурно подобни на цитокининовите рецептори. Бяха проведени изследвания върху мутанти на Arabidopsis, нечувствителни към етилен. Беше изолиран съответният ETR1 ген (триплетен отговор към етилен). Този ген кодира сензорна хистидин киназа, подобна на цитокининовия рецептор. Свързването на етилен към рецептора става с участието на мед. Допълнителни проучвания показват, че етиленът може да се свърже с пет подобни протеина. Всички те принадлежат към неговите рецептори. Разпределението на различни етиленови рецептори е тъканно-специфично. Сигналът от всички рецептори се предава към протеин киназата и по-нататък през MAP киназната каскада. Той активира транскрипционния регулаторен фактор чрез фосфорилиранеи генна индукция. В същото време има доказателства, че G-протеините участват в предаването на етиленовия сигнал от рецептора към MAP киназата. Малко се знае за рецептора на гиберелин, но се смята, че той се намира на повърхността на клетките. Най-добре е проучен механизмът на действие на гиберелините върху образуването на ос-амилаза и други хидролитични ензими в алейроновия слой на покълващите семена. Доказано е, че гиберелинът повлиява de novo синтеза на a-амилаза на ниво транскрипция. Транскрипционният фактор се свързва с ДНК в специфично чувствително към гиберелин място, промотора. Мутация в този регион води до загуба на способността на екзогенния гиберелин да индуцира експресия на α-амилаза. Установена е зависимостта на секрецията на вече образуван ензим от съдържанието на калций и калций-свързващия протеин калмодулин. ABA рецепторът не е идентифициран. Но експериментите с инжектирането на ABA в плазмената мембрана показаха, че рецепторът се намира на повърхността на мембраната. Не е изключено наличието на втори рецептор, разположен вътре в мембраната. Има доказателства, че ABA влияе върху фактора за регулиране на транскрипцията. По този начин взаимодействието с хормона променя конформацията на рецептора, прехвърляйки го в активирано състояние. Активираните мембранни рецептори предават сигнал в клетката, използвайки различни каскадни механизми, включващи вторични посланици. Предаваният сигнал директно взаимодейства с промоторната област на ДНК и с участието на фактор за регулиране на транскрипцията предизвиква генна експресия.
Влиянието на фитохормоните върху новообразуването на протеинови ензими може да се извърши и на пост-грандскрипционно ниво. По-специално е показано значението на гиберелина в този процес. Фитохормоните могат да регулират живота на иРНК, както и процеса на навлизането й в цитоплазмата. Редица изследванияпоказва, че под въздействието на цитокинина се увеличава функционалната активност на рибозомите, както и техният брой, което води до увеличаване на синтеза на ензимни протеини. Има преки експериментални доказателства за връзката на фитохормоните със синтеза на ензимни протеини. Действието на фитохормоните не се проявява, когато се прилагат инхибитори на иРНК и протеиновия синтез. В същото време беше показан ефектът на хормоните върху увеличаването на неоплазмата на иРНК и протеина. При неблагоприятни условия хормоните участват в индукцията на гени, кодиращи образуването на стресови протеини. По този начин ауксините стимулират биосинтезата на ензими като целулаза, целулозна синтетаза, пектин метилестераза, АТФаза и др. Гиберелините активират образуването на редица хидролази и ензими, които катализират синтеза на липиди, изграждащи мембраните. За цитокинините са получени ясни данни за индукция на синтеза на ензими, като нитратредуктаза, RuBP карбоксилаза/оксигеназа и др. Инхибиращите растежа фитохормони (ABA) инхибират синтеза на редица протеини. В същото време ABA, натрупвайки се в семената по време на естествената им дехидратация, индуцира протеинов синтез в късната ембриогенеза. Етиленът активира образуването на ензимни протеини, участващи в процесите, които стимулират узряването на плодовете. Въпреки това, наред с ефекта върху диференциалната активност на генома, ефектът на фитохормоните върху мембраните е от голямо значение. Действието на ниво мембрани, очевидно, е характерно за всички фитохормони. По този начин има доказателства, че под въздействието на ауксин дебелината на мембраните се променя. Хормоните регулират пропускливостта на мембраната. Ауксините и цитокинините увеличават навлизането на йони през мембраните. ABA и етиленът индуцират освобождаването на йони от клетката. Под въздействието на гиберелините се увеличава пропускливостта на мембраните за захари. Доказано е също, че гиберелинът индуцира мембранна неоплазма.ендоплазмен ретикулум, допринасяйки за синтеза на техните липидни компоненти.
Доказано е, че под въздействието на ауксин протоните излизат от външната страна на плазмената мембрана, развива се хиперполяризация на мембраните и се увеличава ΔμH + (V.V. Polevoy). Както е известно, ΔμH + възниква или поради работата на окислително-редукционната верига, или поради разпадането на АТФ в резултат на действието на фазата на АТФ: ΔμH + -> ATP -> ΔμH +. Има доказателства, че IAA активира АТФ-азата, локализирана в плазмалемата. Това може да е причината за активирането на освобождаването на протони (H + -помпа). В същото време ауксините повишават интензивността на дишането чрез ускоряване на работата на дихателната верига (редокс верига), което също може да доведе до увеличаване на освобождаването на протони през митохондриалната мембрана. Този механизъм е една от основите за ефекта на IAA върху растежа на разтягане. Сега се признава, че способността за растеж се определя от енергийния потенциал на клетката (съотношение ATP/ADP). Взаимодействайки с мембраните, фитохормоните въздействат именно на енергийния поток. Засилват се процесите на окислително фосфорилиране (ауксини), фотосинтетично фосфорилиране (гиберелини, цитокинини). Образуван след взаимодействието на фитохормоните с мембраните, АТФ, заедно с използването му за различни синтези, може да служи като източник на образуване на цикличен AMP (cAMP). Последният се образува от АТФ с участието на мембранно свързания ензим аденилат циклаза. Под въздействието на cAMP се активират ензимите протеин киназа, катализиращи фосфорилирането на протеини, участващи в сигналните вериги и транскрипцията. Представеният материал показва, че под влияние на условията на околната среда, както и в зависимост от свойствата на дадена клетка (нейното местоположение) в нея се създава определено съотношение на хормоните. Това от своя страна определя разгръщането на генетичната програма, темпоторастеж, диференциация и развитие. Необходимо е само да се има предвид, че клетката трябва да бъде податлива или компетентна към действието на фитохормоните, по-специално трябва да има подходящи рецептори.