ОСНОВНИ АСПЕКТИ НА КОНСТРУКЦИЯТА НА ГРУНД ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ВИДОВЕ ГОЛЕМИ
Прионните заболявания са специален клас фатални невродегенеративни заболявания при хора и животни, чийто причинител е прион, безнуклеинов протеин с ниско молекулно тегло, който е устойчив на инактивиращи ефекти [1].
През последните години проблемът с прионовите заболявания придоби важно научно и практическо значение, тъй като откриването на приони през 80-те години на миналия век беше пробив в изучаването на инфекциозната патология, микробиологията, молекулярната биология, патоморфологията и философията на живите като цяло [2].
Нарастващият практически интерес към прионните заболявания понастоящем се свързва с огнище на спонгиформна енцефалопатия по говедата в Обединеното кралство („болест на луда крава“) [3]. Разпространението на човешките прионови заболявания е много различно в зависимост от специфичния тип патология и региона, който се изследва. Най-проучваното разпространение на болестта на Кройцфелд-Якоб (CJD), което се среща в почти всички региони с почти същата честота: 0,3-1 случай на 1 милион население годишно [4].
Основните методи за диагностициране на тази патология са следните: гел имунодифузия, изоелектрично фокусиране, радиоизотопен метод и ензимен имуноанализ [5]. Съществуващите методи за определяне на видовете животински протеини обаче се оказват неефективни, тъй като биологичният материал често се подлага на термична обработка, което води до денатурация на протеини, което води до загуба на видовата им специфичност. За разлика от протеините, ДНК е по-устойчива на термична обработка и не губи своята информативна функция.
Следователно използването на молекулярно-генетични методи е обещаващо за определяне на вида на ДНК. Предвид липсата на достъпни и информативни методи, необходими за мониторинг на животинското месо,разработването на PCR тест система за определяне на видовете месни съставки е много уместно.
Цел на изследването
Настоящото изследване е насочено към изучаване на основните аспекти на дизайна на праймера за видова идентификация на ДНК на говеда чрез полимеразна верижна реакция.
Материали и методи на изследване
ДНК шаблонът е конструиран с помощта на метода на полимеразна верижна реакция (PCR) [6], който прави възможно не само получаването на отделни копия на избрани фрагменти от всяка ДНК, но и свързването на тези фрагменти навсякъде. Последното, в комбинация с химическия синтез на ДНК фрагменти, позволява получаването на ДНК шаблони с дадена структура. Тяхната дължина е ограничена само от възможностите на PCR, което позволява получаването на ДНК с дължина до 2900 bp. [7] и повече [8].
Анализът на олигонуклеотидните последователности беше извършен в GenBank с помощта на програмата BLAST.
Параметрите на праймера бяха избрани с помощта на програмата Primer 3.
Резултати от изследването и дискусия
Праймерът е къса част от нуклеинова киселина, която служи като отправна точка за репликация на ДНК в метода на полимеразна верижна реакция (PCR).
Самият дизайн на праймера се предшества от предварителен етап на изграждане на подробен модел на целевия ген или друга последователност на нуклеинова киселина, която се планира да бъде амплифицирана.
За имуно-PCR анализ е необходим ДНК шаблон (ДНК опашка).
За да се намали рискът от фалшиви положителни резултати поради екзогенно ДНК замърсяване, беше разработена ДНК опашка, която в момента не е известна.
Конструирана е синтетична последователност от 194 bp. (като се има предвид, че най-многооптималната дължина се счита за фрагменти в диапазона от 150-300 базови двойки), получени на случаен принцип:
Създадената последователност беше анализирана в GenBank с помощта на програмата BLAST. Използвайки тази програма, наличната последователност беше сравнена с последователности от базата данни и беше определено наличието на хомолози. Извършеният анализ показа, че създадените нуклеотидни последователности нямат хомолози.
Един от ключовите компоненти на реакцията са "праймерите" - синтетичните олигонуклеотиди. Праймерите са комплементарни на противоположните ДНК вериги в областите, които ограничават избраната ДНК област и са ориентирани с техните 3' краища един към друг и към последователността, която трябва да бъде амплифицирана. Дължината на амплифицирания фрагмент се определя от разстоянието между праймерите.
При амплифициране чрез PCR се използват два олигонуклеотидни праймера (праймери). Праймерите са избрани по такъв начин, че полимеразният синтез да протича само между тях, удвоявайки броя на копията на тази ДНК област. Резултатът е експоненциално увеличаване на количеството на определен фрагмент.
Дизайнът на праймера е може би най-критичният параметър за успешна PCR. При други условия, лошо проектиран праймер може да доведе до PCR реакция, която не дава положителен резултат. Последователността на праймера определя редица фактори като позицията и дължината на продукта, неговата точка на топене и, разбира се, добива на продукта. Лошо проектираният праймер може да доведе до малко или никакъв продукт поради неспецифично усилване и/или образуване на димер на праймера, който може да стане достатъчно конкурентен, за да инхибира образуването на продукт. Тезипредоставени са указания за употреба, за да очертаят правилата, които трябва да се вземат предвид при проектирането на PCR праймери.
При проектирането на праймери за PCR трябва да се вземат предвид няколко параметъра. Сред тях са най-критичните:
дължина на грунда. Тъй като специфичността, температурата и времето за отгряване зависят отчасти от дължината на праймера, този параметър е критичен за успешна PCR. В идеалния случай праймерът трябва да бъде с размер между 15 и 30 нуклеотида. Дължината на праймера също е пропорционална на ефективността на отгряване. Ако по-малко шаблони във всеки етап са снабдени с праймери, това може да доведе до значително намаляване на добива на амплифицирания продукт. Грундовете обаче не трябва да са твърде къси, освен ако не са изрично необходими за конкретно приложение.
Температура на топене. И двата олигонуклеотидни праймера трябва да бъдат проектирани така, че да имат приблизително еднаква точка на топене. Ако праймерите не съвпадат за Tm, амплификацията ще бъде по-малко ефективна или може изобщо да не работи, тъй като праймерът с по-висока Tm няма да работи правилно при по-ниска температура.
Tm праймер - температурата, при която концентрацията на праймерните хетеродимери с матрицата е равна на половината от максималната възможна концентрация на такива хетеродимери в реакционната смес.
Разликата в Tm между два праймера от една и съща двойка не трябва да надвишава 4-6 градуса. Ако Tm на двата праймера се различава значително, тогава праймерът с най-нисък Tm може да бъде удължен от 3'-края (със същия размер на крайния продукт) или 5'-края (с еквивалентно увеличение на размера на крайния продукт).
Специфичност. В идеалния случай грундът трябва да има 100%комплементарност по отношение на целевото място и не разпознават други, дори много близки по нуклеотиден състав, последователности. Практиката обаче показва, че праймери, които нямат 100% комплементарност и имат достатъчно висока степен на хомоложност (но не повече от 70%) по отношение на други нуклеотидни последователности, също могат да бъдат ефективни.
Специфичността на праймера е, поне отчасти, зависима от дължината на праймера. Очевидно има много повече уникални олигонуклеотиди с 24 бази, отколкото тези с 15 бази. По този начин праймерите трябва да бъдат избрани така, че да имат уникална последователност в рамките на ДНК шаблона, който да бъде амплифициран. Праймер, предназначен да съдържа силно повтаряща се последователност, ще доведе до размазано петно при амплифициране на геномна ДНК. Въпреки това, същият праймер може също да има единична лента, ако се амплифицира единичен клон от геномна библиотека. Поради факта, че Taq-ДНК полимеразата е активна в широк диапазон от температури, удължаването на праймера ще се случи при по-ниски температури на отгряване. Ако температурата е твърде ниска, може да възникне неспецифично функциониране на праймера, което може да нарасне под действието на полимеразата, ако има къса хомология в 3' края. Като цяло, точка на топене от 55-72°C дава най-добри резултати.
Допълнителна праймерна последователност. Праймерът трябва да бъде проектиран така, че да няма абсолютно никаква вътрешна хомология, надвишаваща 3 нуклеотидни двойки. Ако праймерът има такава област на хомология, могат да бъдат създадени частично двойноверижни структури като "обратен колапс" или "фиби", които ще пречат на отгряването към шаблона. Друга относителна опасност -това е хомологията между праймерите. Частична хомология възниква в 3' края на всеки праймер, ще се образува димер, който най-често ще противодейства на образуването на желания продукт.
20 бази. Това ще даде Tm в диапазона от 56-62°C.
Вторична структура на праймера. Праймерът не трябва да се вписва във вторична структура, чиято точка на топене е еквивалентна или по-висока от Tm на праймера. В присъствието на такава структура, ефективността на праймерното свързване със съответната нуклеотидна последователност на целевото място ще бъде ниска.
Вторична структура на целевия сайт. Целевото място (област на шаблона, комплементарна на праймера) не трябва да се вписва във вторична структура, чиято точка на топене е еквивалентна или по-висока от Tm на праймера. В присъствието на такава структура, ефективността на свързване на праймера към целевото място ще бъде ниска.
Хомо- и хетеродимеризация на праймери. Възможността за хомо- и хетеродимеризация на праймери при температура, равна или по-висока от тяхната температура на "отгряване", трябва да бъде напълно изключена, особено от 3'-края, тъй като това може да доведе до намаляване на добива на крайния PCR продукт (до пълното му отсъствие).
Като се имат предвид представените параметри, за синтезираната ДНК опашка бяха избрани следните 2 праймера с размер 20 bp:
1) >>>>>> ляв праймер - от 41 bp - AGTCAGTCCTTGGCCTCCTT