Указания за лабораторна диагностика на хламидийни инфекции при животни, Метод

1. Общи положения

1.1. Лабораторните методи за изследване на хламидиални инфекции на животни включват: - откриване на специфични антитела в кръвния серум на болни животни в RSK (RDSK) или ELISA; - откриване на хламидии и техните антигени в патологичен материал чрез светлинна или луминесцентна микроскопия; - изолиране на хламидия върху пилешки ембриони в клетъчна култура или лабораторни животни с последващата им идентификация; - откриване на ДНК на хламидия в патологичен материал чрез полимеразна верижна реакция (PCR).

1.2. Следното се изпраща в лабораторията за изследване на хламидиални инфекции: - кръвен серум в размер на 3-5 cm от животни, които са абортирали или са съмнителни за заболяването, както и във всички случаи, предвидени от настоящите инструкции. Взема се кръв от абортирани животни два пъти: в периода на клиничната изява на заболяването и повторно от тях след 14-21 дни. Серумът се изпраща в лабораторията в количество от 1-2 cm3. Серумите се съхраняват при минус 20°C и се изследват едновременно. Серуми, хемолизирани или замърсени с бактериална и гъбична флора, са неподходящи; - патологичният материал (остъргвания от конюнктивата, гениталиите, изпражненията) се взема само с еднократни или стерилни инструменти в пластмасови епруветки за еднократна употреба с капачки или в стерилни епруветки (флакони) с гумени запушалки с физиологичен разтвор в размер на 1 cm и се доставя в лабораторията в контейнери за лед в рамките на 24 часа. Материалът може да се съхранява не повече от 7 дни при 4°C и 10-12 месеца при минус 20°C; - проби от еякулат или замразена сперма, получени от производители, за които се подозира, че имат заболяване. Проби от еякулат се изпращат за изследване в размер на 1 cm;замразена сперма в количество най-малко 2 гранули се доставя в лабораторията в контейнер с течен азот или в епруветка със сух лед; - патологичен материал от умрели или умъртвени болни животни (парченца от паренхимни органи, лимфни възли и тестиси), от абортирани животни (парченца от плацента); - цели абортирани фетуси или паренхимни органи и абомасум на плода. Патологичният материал се взема в стерилни, херметически затворени флакони не по-късно от два часа след смъртта, клането на животното или аборта. Флакони с патологичен материал се поставят в термос с лед, а абортираните плодове се поставят във влагоустойчив контейнер и се доставят в лабораторията в същия ден, но не по-късно от 24 часа, при спазване на мерките, които изключват разпространението на инфекциозния агент.

2. Серологични изследвания

2.1. Серологичните изследвания за хламидийни инфекции се основават на откриването на специфични антитела в кръвния серум на животни в реакцията на фиксиране на комплемента (CSC), дългосрочната реакция на фиксиране на комплемента (RDSC) и ензимен имуноанализ (ELISA), при абортирани животни - при установяване на повишаване на титъра на антителата 4 или повече пъти. Животните, ваксинирани срещу хламидиален аборт, не се изследват серологично в продължение на 1 година след ваксинацията.

2.2. В RSK, RDSK се използват следните компоненти: - комплемент-фиксиращ групово-специфичен хламидиен антиген; - контролен антиген; - положителен (имунен) кръвен серум от овце, съдържащ групово специфични хламидиални антитела; - отрицателен (отрицателен) кръвен серум на овце; - комплемент (пресен, консервиран или лиофилизиран кръвен серум от морско свинче); - хемолизин (серум от заешка кръв,овце, имунизирани с еритроцити); - овчи еритроцити; - тест серуми; - физиологичен разтвор, рН 7,0-7,2. Специфични и контролни антигени, положителни и отрицателни серуми се произвеждат от биофабрики, които ги произвеждат в специални комплекти. Антигенът се разрежда в дестилирана вода и се използва в RSK, RDSK в работните титри, посочени на етикета.

2.3. Хемолизинът в RSK и RDSK се използва в двоен титър (например при титър на хемолизин 1: 1000 се приема 2: 1000).

2.4. Овчите еритроцити се промиват с физиологичен разтвор чрез центрофугиране при 2500-3000 rpm за 10-15 минути, докато супернатантата стане напълно прозрачна. За CSC се използва 2,5% суспензия, за RDSC - 3% суспензия от еритроцити от седимента. Преди работа суспензия от еритроцити и хемолитичен серум в работно разреждане се смесват в равни обеми, получената хемолитична система се поставя в термостат при 37 ° C за 20-30 минути за сенсибилизация. По време на работа хемолитичната система се съхранява на стайна температура или в хладилник при 2-4°C.

2.5. Само пресни тестови серуми са подходящи за серологично изследване. Веднъж замразени, както и серуми, консервирани с борна киселина (2% обемни) или мертиолат (1: 10000) се допускат за изследване.

Мътни, покълнали или хемолизирани серуми са неподходящи за тестване.

2.6. Приготвя се физиологичен разтвор за разреждане на компонентите (0,85% разтвор на химически чист натриев хлорид в дестилирана вода, рН 7,2-7,4), който се вари в продължение на 5 минути на ден или в деня на реакцията.

2.7. Изявление на реакцията на свързване на комплемента (RSC).

2.7.1. Реакцията се поставя в обем от 1 cm (0,2 cm от всекикомпонент). Комплементът се титрува всеки път преди основния експеримент върху положителни и 1-2 тестови серума.

2.7.2. Титруване на комплемента. Сухият биофабрикен комплемент се разтваря във физиологичен разтвор до оригиналния обем, посочен на етикета, и се приготвя основно разреждане 1:20. Всеки серум, разреден 1:5 (1 ml серум + 4 ml физиологичен разтвор), се инактивира при 58-60°C за 30 минути, излива се на 0,2 cm в два реда епруветки на стенда Florinsky. Титруването на комплемента започва с доза от 0,02 cm до 0,2 cm с интервал от 0,02 cm. За да направите това, добавете десетократно разреден комплемент 1:20 в дози от 0,2 към допълнителен ред епруветки; 0,4; 0,6 и т.н. до 2,0 cm и във всяка епруветка добавете количеството физиологичен разтвор, което липсва до 2 cm, т.е. 1.8; 1.6; 1.4 и т.н. След това от първото разреждане на комплемента 0,2 cm 3 се прехвърлят в първите епруветки на всички серуми, съответно от второто разреждане във второто и т.н. (това може да се направи с апарат на Флорински с обемни пипети 0,2 cm). Първите редове епруветки с положителни и тестови серуми (взети от експеримента) изсипват специфичния антиген в работно разреждане в антигенни редове от 0,2 cm, а във вторите редове - 0,2 cm физиологичен разтвор. Епруветките се разклащат и се поставят на водна баня за 60 минути при 37-38°С. След това хемолитичната система се излива във всички епруветки по 0,4 ml, разклаща се и се поставя на водна баня за 20 минути при 37-38 ° C (виж схемата за титруване на комплемента в таблица 1).

СХЕМА ЗА ТИТРУВАНЕ НА КОМПЛЕМЕНТА (ОТ ПЪРВИЯ РЕД ЕПРВЕНКИ)