5. Контрол на работата на биотехнологичните производства 13. Основи на микробиологичния контрол на биотехнологичните производства
Микробиологичният контрол на биотехнологичните производства е задължителен и важен етап от общия контрол на производството и контрола на процесите.
Значението на микробиологичния контрол се дължи на необходимостта да се осигури доминиране на промишлен щам на етапа на култивиране и строга последователност от биосинтетични процеси, които гарантират ефективността на производството на висококачествен целеви продукт, както и изискванията за създаване на екологично чисто производство, за да се гарантира безопасността на персонала, участващ в производството и опазването на околната среда.
Микробиологичният контрол на биотехнологичните производства включва няколко компонента.
1. Микробиологични характеристики на течни и въздушни потоци:
определяне на заразяване на входящи потоци;
определяне на санитарното състояние на производственото оборудване и помещения.
2. Микробиологична характеристика на производствената култура:
определяне на чистотата (липса на замърсяване) на семена и производствени култури (при защитени процеси) или доминиране на производствения щам (при незащитен процес);
определяне на показателите за физиологичното и биохимичното състояние на културата, които определят получаването на целевия продукт с необходимото качество.
3. Микробиологични характеристики на качеството на готовия продукт:
определяне на общото замърсяване,
определяне на живи клетки на производителя.
4. Санитарен и микробиологичен контрол:
състоянието на работната зона;
състоянието на отпадъчните потоци (въздух, вода) и околната среда.
Показателите за микробиологичен контрол и критериите за оценка се определят от изискванията на технологичния регламент и работните инструкции. Методиконтролните и допустимите показатели на етап 4 се основават на одобрените норми на ПДК и съдържанието на техногенни фактори в работната зона (въздух, работни повърхности и др.).
Методите за контрол и допустимите показатели съгласно параграф 4 се основават на нормите на МДГ и ПДР, одобрени за всяко предприятие. Методите за контрол и необходимите показатели съгласно точка 3 се определят от регулаторни и технически документи (технически спецификации, GOST и др.) За произвеждания продукт.
Следното е примерна схема за микробиологичен контрол на производството на биомаса от дрожди при условия на незащитена култура. Определянето съгласно претенция 2 се извършва по време на осъществяването на непрекъснат процес на култивиране, тъй като в резултат на протичащите процеси на автоселекция може да настъпи промяна в структурата на популацията на култивирания щам.
При защитени процеси на култивиране (стерилни) се контролира стерилността (т.е. липсата на замърсяване) на входящите потоци, липсата на замърсяване на инокулума и крайния продукт.
Целта на работата:Да се извърши микробиологичен контрол на суспензия от дрожди, да се научат как да се определи доминирането и стерилността на производствения щам на дрожди в културата на етапа на подготовка на посевен материал или промишлено отглеждане.
Приготвяне на петриеви панички
Разтопената на кипяща водна баня агаризирана среда (уорт-агар) се налива в стерилни петриеви панички по 20÷30 ml всяка. Чашите се оставят на хоризонтална повърхност до втвърдяване на агара, след което се държат 2-3 дни при 30°С с капаци надолу, за да изсъхне повърхността на средата и да се провери нейната стерилност. Избират се съдове за инокулация, средата в която остава стерилна.
Избор на разреждания за инокулация
Броят на разрежданията се приготвя за всеки видизолирани колонии на повърхността на агаровата среда. Разрежданията се приготвят в епруветки с 9 ml стерилна чешмяна вода. Избраната проба от суспензията се разбърква старателно, равномерно, след което се взема и прехвърля с пипета от 1 ml в епруветка с 9 ml стерилна вода (първо разреждане 1:10). Суспензията от полученото първо разреждане трябва да се смеси добре с нова стерилна пипета, като получената суспензия се изтегли в пипетата и се освободи от нея. Тази процедура се повтаря 3÷5 пъти, което осигурява смесването на суспензията и намалява адсорбцията на клетките по стените на пипетата. След това със същата пипета вземете 1 ml от полученото разреждане и го прехвърлете във втората епруветка - това е второто разреждане - 1:100. Следващите разреждания се приготвят по подобен начин.
Степента на разреждане се определя от очаквания брой микроорганизми в суспензията и съответно броят на разрежданията е толкова по-голям, колкото повече микроорганизми има в първоначалната суспензия или субстрат. Обикновено е 5÷8, най-често 6 разреждания. За приготвянето на всяко разреждане не забравяйте да използвате отделна пипета! Пренебрегването на това просто правило може да доведе до грешен резултат, понякога 100 или повече пъти по-висок от истинския. Грешката е свързана с адсорбцията на микроорганизми по стените на пипетата, в резултат на което не всички клетки се отстраняват от пипетата. Част от клетките, останали по стените на пипетата, могат след това да попаднат в едно от следващите разреждания, което ще доведе до надценен резултат.
За потискане на растежа на бактериите към анализираната дрождена суспензия или към разтопения и охладен до 45°C мъст агар се добавят антибиотици – трептомицин, неомицин (50 единици/ml), тетрациклин, окситетрациклин и хлортетрациклин (0,002÷005 mg/ml).
Засяването се извършва със стерилна пипета от последните разреждания,започвайки от най-новото. След старателно смесване се вземат 0,1 ml от суспензията и се нанасят върху повърхността на блюдото с мъст-агар в петриево блюдо. Този обем се разпределя равномерно по повърхността на средата със стерилна шпатула.
За култури от различни разреждания се използва нова стерилна шпатула. Чаши с инокулационни среди се увиват в хартия, като предварително се записва датата на засяване и съотношението на разреждане върху капаците, обръщат се надолу и се поставят в термостат (32÷34°C). Като контрола се засява еднодневна култура от производствения щам дрожди.
Преглед на пораснали колонии се извършва в продължение на 3÷5 дни. Пребройте общото количество мая и гъбички. Отделно се определя броят на дрождените колонии, идентични с производствения щам, чрез сравнение с контролната инокулация, както и броят на колониите от различни морфологични типове, които се различават от производствения щам. Гъбичната инфекция се определя като процент на гъбични колонии към общия брой колонии, растящи върху съда. Колониите дрожди, подобни на и различни от производствения щам, се анализират чрез допълнителни тестове.
Варианти на дрожди, които се различават от производствения щам, се наричат чужди дрожди.
Резултатите от анализа се записват като дроб
където D е доминирането на производствения щам в % от общия брой отгледани колонии;
C - стабилност на производствения щам в % спрямо броя на колониите, сходни по морфология с културата-производител, към общия брой колонии на културата-производител.
Определяне на общото замърсяване чрез инокулация върху MPA (месен пептон агар)
Същността на метода се състои в преброяването на колониите, образувани от мезофилни аеробни бактерии при инокулиране на тестовата суспензия върху благоприятнахранителна среда и термостатиране при 34С и при 37С - при анализ на готовия продукт.
Вземането на проби от дрождената суспензия за анализ се извършва по същия начин, както е описано по-горе, и за анализ на готовия продукт се взема проба от 1 g от продукта в стерилна епруветка с шпатула, избърсана с памучна вата, навлажнена с алкохол, последвано от изгаряне на огън.Към пробата се добавят 9 ml стерилна чешмяна вода и се смесват добре със стерилна пръчка, за да се получи хомогенна суспензия. От първото разреждане 1:10 се приготвят последващи разреждания - 1:100 и т.н. Редът на разреждане се избира в зависимост от очакваното замърсяване на продукта, така че 30 до 300 бактериални колонии да се развият върху петриеви панички.
Приготвянето на месопептонен агарсе извършва чрез добавяне на 10 g пептон и 5 g натриев хлорид към приготвената месна вода. Ако в месопептонния бульон се образува утайка, тя трябва да се филтрира отново. Преди стерилизация 20 g агар се добавят към 1 литър месопептонен бульон и се варят на слаб огън при непрекъснато разбъркване до пълното разтваряне на агара. pH се регулира до 7,0÷7,2 и се излива в епруветки, колби или флакони. Стерилизирайте 20 минути на 120°C.
Месопептонният агар може да бъде заменен със сух хранителен агар, средата от която се приготвя съгласно предписанието, приложено към всяка партида суха среда. При получаване на всяка нова партида сух хранителен агар е необходимо да се контролира качеството на приготвената от него среда. Ако инокулацията върху среда, приготвена от сух хранителен агар, даде незадоволителни резултати, тогава към тази среда се добавя 1/3÷1/4 месо-пептонен бульон, за да се доближи съставът й до MPA.
Приготвяне на разтвор на нистатин
Приготвянето се извършва чрез разтваряне на предварително смлени в хаванчепрах от една обвита таблетка нистатин (медицински нистатин, опаковка от 20 таблетки по 500 000 единици) в 100 ml 80% разтвор на етанол. Полученият разтвор на нистатин с концентрация 5000 IU/ml се филтрира.
Подготовка на пробата за анализ
Към дрождената суспензия, взета от ферментатора, добавете нистатин в концентрация 60÷100 IU/ml, за да потиснете растежа на дрождите. Общият брой бактерии в тестовата проба се определя в 1 ml или 1 g. Разреждането за инокулация се избира въз основа на очакваното ниво на бактериално замърсяване. От всяка приготвена проба 0,1 ml се инокулира в 2-3 чаши с предварително маркирано дъно (посочени са датата на засяване, разреждането и кодът на пробата). Този обем се разпределя равномерно по повърхността на средата със стерилна шпатула. Петриевите блюда се обръщат с главата надолу за 2-3 дни, поставят се в термостат при 34 ° C или 37 ° C (при анализ на готовия продукт).
Броят на порасналите колонии се преброява във всяка чаша, като се поставя обърната (без капак) на тъмен фон, с помощта на лупа с увеличение 8-10 пъти. Преброените колонии се маркират с точка на дъното на съда с помощта на стъкло или флумастер върху стъкло. При голям брой колонии дъното на петриевото блюдо се начертава на няколко еднакви сектора, изчислява се броят на колониите в 2–3 сектора и средният брой, намерен за един сектор, се умножава по броя на секторите. Също така е удобно да се преброяват по групи, когато, след като преброят група колонии от не повече от 20 броя, те я очертават и записват намереното число на дъното на чашата. Направете същото с всички съседни групи. Числата, записани на всички сайтове, се сумират. В този случай не е необходимо предварително да се изчертае дъното на съда, размерът на зоните, в зависимост от плътността на колониите, може да бъде различен.
Изчисляването на общото замърсяване се извършва по формулата:
където N е броят на бактериите в 1 ml (или 1 g) от първоначално анализираната проба;
X е общият брой на преброените колонии при посяване на това разреждане;
a е факторът на разреждане;
n е броят на повторенията;
V е обемът на суспензията, взета за инокулация, ml.
Всички отработени епруветки и колби с инокулум и блюда със среди и отработени култури трябва да бъдат автоклавирани. Пипети, предметни стъкла и други видове стъклария се потапят напълно в 3% разтвор на хлорамин. След третиране с хлорамин съдовете се варят 30 минути, след което се измиват със студена вода.
След приключване на работата по повърхностите на работните маси, вътрешните повърхности на термостатите се третират със 70% етанол.
Опишете структурата на микробиологичния контрол на биотехнологичните производства.
Каква е целта на микробиологичния и бактериологичен контрол на биотехнологичните производства?
Посочете основните методи за микробиологичен контрол.