Чувствителност на бифидобактериите към антимикробни средства
Целта на нашето изследване беше да се анализира чувствителността към антибиотици на различни щамове на Bifidobacterium spp. към широк спектър от антимикробни средства.
Методи: Петдесет щама, принадлежащи към осем вида бифидобактерии, бяха тествани за чувствителност към 30 антибиотика чрез дискова дифузия, използвайки Brucella agar, допълнен с 5% лакирана овча кръв и витамин K1 (1 mg/L). Минималните инхибиторни концентрации (MIC) на девет антианаеробни средства, включително три нови средства (телитромицин, линезолид и гатифлоксацин), бяха определени с помощта на стандартен метод за разреждане на агар.
Резултати: Всички щамове на бифидобактерии от всякакъв вид са чувствителни към пеницилини: пеницилин G, амоксицилин (MIC50 0,06 mg/l), пиперацилин, тикарцилин, имипенем и обикновено към антибиотици срещу грам-положителни бактерии (макролиди, клиндамицин, пристинамицин, ванкомицин и тейкопланин). Чувствителността към цефалотин и цефотетан е променлива. Повечето култури (70%) са устойчиви на фузидова киселина. Както се очакваше, се наблюдава висока степен на резистентност към аминогликозидите. Установено е, че метронидазолът, агент, известен със своята антианаеробна активност, е неефективен срещу 38% от щамовете. Новите налични в търговската мрежа средства, телитромицин, линезолид и гатифлоксацин, бяха активни при MIC50 от 1 mg/l. Единствената промяна в чувствителността се наблюдава сред различните видове за щама Bifidobacterium breve, който изглежда като цяло е по-устойчив. Потенциално придобита резистентност се наблюдава само срещу тетрациклин и миноциклин, при 14% от щамовете.
Заключение: По отношение на общия въпрос за безопасността на пробиотиците, като показатели за потенциална поносимост,бифидобактериите, с тяхната ниска естествена и придобита резистентност към 30 антибиотика, се считат за безрискови.
Бифидобактериите са анаеробни, Грам-положителни пръчковидни организми с характерен Y или V-образен край. Те обитават главно чревната и вагиналната лигавица на човешки и животински организми 1 . Бифидобактериите принадлежат към групатамлечнокисели бактерии (LAB), която включва пробиотични щамове на млечнокисели бактерии, бифидобактерии и ентерококи 1 . Те са известни като пробиотични организми поради тяхното потенциално благоприятно действие в чревния тракт, особено по отношение на поддържането на микробния баланс чрез инхибиране на растежа на патогенни микроорганизми 2 . Репутацията на бифидобактериите като промотори на здравето е довела до използването им в допълнително бактериално хранене и в превенцията и лечението на стомашно-чревни инфекции и диария, свързани с антибиотично лечение 3,5.
Съобщава се за гени на резистентност към антибиотици в много LSDs и трансфер на плазмиди и конюгативни транспозони към и от MBDs, в Enterococcus и Lactobacillus видове. Доколкото ни е известно, конюгативните плазмиди не са описани в бифидобактерии 1 . Въпреки това, щамовете на бифидобактериите могат да бъдат патогенни и да причинят стомашно-чревни и извънчревни инфекции, въпреки че тези инфекции рядко се описват. Патогенни щамове на бифидобактерии са изолирани от патогени, открити в коремната област, в абсцеси, акушерски/гинекологични области и в гръдния кош8. Bifidobacterium dentium и Bifidobacterium adolescentis са отговорни за половината от тези инфекции и също така участват, както е описано в друго проучване, в бактериемия 9 .
Чувствителностbifidobacteria към антимикробни средства не е сериозно поставено под въпрос досега и малкото данни, налични в литературата, са разнородни и противоречиви. Това изследване е проведено, за да се определи точно чувствителността на щамовете на Bifidobacterium, изолирани от различни източници, към няколко групи общи антимикробни средства.
Материали и методи
Бактериални щамове
Изследвани са петдесет щама бифидобактерии, включително седем референтни щама, получени от колекцията на института Пастьор (Париж, Франция). Тези щамове, представляващи различни видове бифидобактерии, са изолирани от различни среди, 15 щама от изпражнения на възрастни, 26 от изпражнения на новородени или бебета, пет от пробиотични продукти, два от черва на бебета, един от изпражнения на животни и един от кариозна кухина на човек. Броят на тестваните щамове е разделен, както следва: Bifidobacterium longum, 14; Bifidobacterium pseudocatenulatum, 11; Bifidobacterium bifidum, 8; Bifidobacterium animalis/Bifidobacterium lactis, 8; Bifidobacterium breve, 6; B. adolescentis, 1; Bifidobacterium angulatum, 1; B. dentium, 1. Clostridium perfringens ATCC 13124T, Bacteroides fragilis ATCC 25285 и Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741, получени от American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) бяха използвани като контролни щамове, както беше предложено от Националния комитет по клинични лабораторни стандарти.
Бульон, съдържащ триптон пептон (30 g/l), глюкоза (5 g/l), екстракт от дрожди (20 g/l) и хемин (5 mg/l) се използва за култивиране на щамовете в течна среда (TGYH). Brucella agar (BBL, Becton Dickinson, Les Ponts de Clays, Франция), допълнен с 5% лаковча кръв и витамин K1 (1 mg/l), се използва за култивиране на щамове върху твърда среда и за тестове за антимикробна чувствителност.
Всички експерименти бяха проведени в анаеробна камера (Don Whitley, AES Laboratoire, Combourg, Франция), промита с газова смес без O2 (CO2/H2/N2, 10/10/80).
Тестове за антимикробна чувствителност
В първата част на изследването е извършено изследване на антимикробната чувствителност на бифидобактериални щамове по метода на дискова дифузия, съгласно препоръките на CA-SFM (Комитет по антибиотици към Френското дружество по микробиология) 10 . Изходните култури се държат при 80°С в криостъкло в бульон от мозъчен сърдечен екстракт, съдържащ глицерол (15% v/v) и анаеробно прехвърлени в Brucella agar при 37.8°C 48 часа преди изследването. След това инокулумът за всеки тестов организъм се приготвя чрез суспендиране на клетките в бульон TGYH, за да се постигне мътност, еквивалентна на 1,0 стандарт на McFarland (3 х 108 клетки/mL) и се поставя върху агарово блюдо. Стандартни дискове с 32 антимикробни средства бяха поставени върху повърхността на съдовете. Диаметрите на зоната на инхибиране бяха измерени след анаеробна инкубация при 37.8°С за 48 часа. Антибиотичните дискове са получени от Bio-Rad, Marne la Coquet, Франция, с изключение на метронидазол (Neo-Sensitabs, Roscoe, Дания) и телитромицин (Oxoid, Dardilly, Франция).
Във втората част на проучването MIC на девет антибиотика (пеницилин G, амоксицилин, цефокситин, тетрациклин, еритромицин, телитромицин, линезолид, ванкомицин и гатифлоксацин) са определени с помощта на референтния метод за разтваряне на агар, препоръчан от CA-SFM и NCCLS (Национален комитет за клинични и лабораторни изследвания).стандарти) 10.11.
Пеницилин G,амоксицилин, цефокситин, ванкомицин, тетрациклин и еритромицин бяха избрани за тестване на най-честите механизми на придобита резистентност при грам-положителни анаероби.
Телитромицин, линезолид и гатифлоксацин бяха избрани, защото те са нови антибиотици.
Телитромицин, гатифлоксацин и линезолид бяха предоставени като стандартизирани прахове, съответно от Aventis Pharmaceuticals (Romainville, Франция), Grunenthal (Париж, Франция) и Pharmacia-Upjohn (Guyancourt, Франция).
Прахове с известна ефективност пеницилин G, амоксицилин, цефокситин, тетрациклин, еритромицин и ванкомицин са получени от търговски източници.
Разтвори от 512 mg/l от всеки антибиотик бяха приготвени в подходящи разтворители, плюс двойно разреждане в дестилирана вода преди смесване с Brucella агар, допълнен с лакирана овча кръв и витамин K1. Всички чаши са използвани в рамките на 24 часа след приготвянето им. Семената се приготвят за всеки тестов организъм чрез суспендиране на клетки в бульон TGYH за постигане на мътност, еквивалентна на 1,0 стандарт на McFarland (3 х 108 клетки/mL) и се поставят чрез репликаторния метод на Steer върху агарови плочи. В началото на всяка тестова серия се инокулира блюдо без антимикробни средства, за да се определи жизнеспособността на организмите и да се използва като контрола за сравнение на растежа. Чашите се държат в анаеробна камера при 37.8°C в продължение на 48 часа. Тъй като крайните точки могат да бъдат трудни за определяне за анаероби, MIC се определя като най-ниската концентрация на антимикробен агент, която води до липса на растеж или само до няколко колонии, илизначително намаляване на растежа, както се препоръчва от NCCLS 12 . Нивата на резистентност бяха изчислени според френските гранични стойности (mg/l), които са предимно идентични с граничните стойности на NCCLS и съответстват на следното: пеницилин G (>16), амоксицилин (>16), цефокситин (>32), тетрациклин (>8), еритромицин (>4), телитромицин (>2), линезолид (>g t;4), ванкомицин (>16) и гатифлоксацин (>2). Всеки експеримент се повтаря три пъти в дубликат и включва контролни щамове.
Изследвания на β-лактамазната активност с помощта на нитроцефинови тестове
Дискове от хромогенен цефалоспорин, нитроцефин (bioMe'rieux, Marcy-l'Etoile, Франция) бяха използвани за определяне на β-лактамазната активност 13 . B. fragilis ATCC 25285 се използва като положителна контрола.
Тестове за определяне на детерминантите на резистентност към тетрациклин чрез PCR
Общата геномна ДНК беше извлечена от всички тетрациклин-резистентни щамове и използвана за амплификация с дегенерирани праймери, които идентифицират всички известни Tcr гени за рибозомна защита. Амплификации също бяха извършени с праймери, характерни за tet(M) и tet(W) гените. Условията на PCR и комплектите праймери са както е описано от Barbosa et al., 14 Roberts et al. 15 и Scott et al. 16 E. faecium UW7 се използва като положителна контрола за tet(M) и дегенерирана tet PCR, а Butyrivibrio fibrisolvens 1.230 се използва като положителна контрола за tet(W) PCR 14-17.
резултати
Резултатите от дискови дифузионни тестове за антимикробна чувствителност на 50 щама бифидобактерии са показани вТаблица 1, и MIC на девет антимикробни средства, включително нови вещества, пуснати на пазара всерийно производство, телитромицин, линезолид и гатифлоксацин са показани вТаблица 2.
Таблица 1. Чувствителност на бифидобактерии към антимикробни агенти, използвайки метод на дискова дифузия