ДНК метилиране
ДНК метилиранетое модификация на ДНК молекула без промяна на самата ДНК нуклеотидна последователност, която може да се разглежда като част от епигенетичния компонент на генома [1] [2] [3] .
ДНК метилирането се състои в добавянето на метилова група към цитозина като част от CpG динуклеотид в С5 позицията на цитозиновия пръстен. Метилирането в промоторната област на ген обикновено води до потискане на съответния ген. След това метилираният цитозин може да бъде окислен от специфични ензими, което в крайна сметка води до неговото деметилиране обратно до цитозин [4] .
Счита се, че ДНК метилирането е характерно главно за еукариотите. При хората около 1% от геномната ДНК е метилирана. При възрастни соматични клетки ДНК метилирането обикновено се случва при CpG динуклеотиди; Метилирането на ДНК извън CpG динуклеотидите се случва в ембрионалните стволови клетки. [5] [6]
Освен това, ДНК метилирането извън CpG динуклеотидите е отличителен белег на епигенома на плурипотентни стволови клетки и намаляването на не-CG метилирането е свързано с нарушена способност за диференциране в ендодермални клетъчни линии [7]
В растенията метилирането на цитозин се извършва както симетрично по двете вериги (на CpG или CpNpG), така и асиметрично само на една от двете вериги (на CpNpNp, където N означава всеки нуклеотид).
Съдържание
Около 60-70% от всички CpG динуклеотиди при бозайниците са метилирани. Неметилираните CpG динуклеотиди се групират в т.нар. "CpG острови", които присъстват в 5' регулаторните области на много гени. Различни заболявания, като рак, са придружени от първоначално анормално хипометилиране на ДНК и последващо хиперметилиране на CpG острови в промоторните области на гените, което води до продължителна репресия.транскрипция. Транскрипционната репресия в този случай се медиира от протеини, способни да се свързват с метилирани CpG динуклеотиди. Тези протеини, наречениметилцитозин-свързващи протеини, набират хистон деацетилаза (HDAC) и други фактори, участващи в ремоделирането на хроматина. Образуваният комплекс може да модифицира хистони, образувайки кондензирана транскрипционно неактивна хетерохроматинова структура. Влиянието на метилирането на ДНК върху структурата на хроматина е от голямо значение за развитието и функционирането на живия организъм. По-специално, отсъствието на метилцитозин-свързващ протеин 2 (MeCP2), дължащо се например на мутация в съответния ген, води до развитие на синдром на Rett при хора; инактивиране на метилцитозин-свързващ домен протеин 2 (MBD2), който участва в потискането на транскрипцията на хиперметилирани гени, е отбелязано при онкологични заболявания.
ДНК метилиране при хора
При хората три ензима, наречени съответно ДНК метилтрансферази 1, 3a и 3b (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b), са отговорни за метилирането на ДНК. Предполага се, че DNMT3a и DNMT3b саde novoметилтрансферази, които образуватмоделна ДНК метилиране в ранните етапи на развитие, както и неговите промени по време на клетъчната диференциация. Съществува хипотеза, чеde novoДНК метилирането се причинява по-специално от интерфериране на РНК чрез РНК-зависимо ДНК метилиране, процес, възникнал по време на еволюцията за потискане на мобилните елементи на генома. [8] DNMT1 е ДНК метилтрансфераза, която поддържа метилираното състояние на ДНК чрез добавяне на метилови групи към една от ДНК веригите в точки, където друга, комплементарна верига,метилиран. Предполага се, че неполиаденилираните дълги некодиращи РНК (lncRNA) играят ролята на инхибитори на DNMT1, които регулират метилирането на ДНК [9] Протеинът DNMT3L е хомоложен на други протеини DNMT, но няма каталитична активност. Вместо това, DNMT3L поддържаde novo-метилтрансферази, улеснявайки свързването на тези ензими с ДНК и стимулирайки тяхната активност.
Важни етапи в развитието на злокачествените новообразувания са предварителното хипометилиране на ДНК [10] и последващото инактивиране на гените, потискащи растежа на тумора [11] . В случая, когато инактивирането се дължи на метилиране на промоторната област на гена, бяха проведени експерименти за възстановяване на експресията чрез инхибиране на DNMT. 5-аза-2'-деоксицитидин (децитабин) е нуклеозиден аналог, който инхибира DNMT метилтрансферазите. Механизмът на действие на лекарството се основава на ковалентното свързване на ензима в комплекс с ДНК, което прави невъзможно изпълнението на функцията на ензима и води до разграждане на метилтрансферазата. Въпреки това, за да бъде активен децитабин, той трябва да се интегрира в генома на клетката, но това от своя страна може да причини мутации в дъщерните клетки, ако клетката не умре и продължи да се дели. В допълнение, децитабинът е токсичен за костния мозък, което ограничава неговото терапевтично приложение. Тези ограничения доведоха до интензивно търсене на терапевтични интервенции, базирани на използването на "антисенс" РНК, които противодействат на DNMT чрез разграждане на неговата иРНК и следователно блокират транслацията. Способността за селективно деметилиране на ген и по този начин да се промени неговата експресия се осигурява от откриването на така наречената екстракодираща РНК (екстракодираща РНК), която е в състояние да се свързва с DNMT1, блокирайки способността му даизвършват метилиране на определен ген [12] . Остава обаче въпросът дали инхибирането на функцията DNMT1 е достатъчно условие за повишена експресия на супресорни гени, чиято транскрипция се регулира надолу чрез метилиране на ДНК.
Анализът на човешки персонални транскриптоми и метиломи показа, че корелацията между метилирането и генната експресия се наблюдава само в по-малко от 20% от гените [13]
Young и др. разработи ефективен метод за селективно насочено деметилиране на специфични CpG в човешки клетки, използвайки TALE (транскрипционен активатор-подобен ефектор) селективен ДНК-свързващ домен, комбиниран чрез молекулярно инженерство и TET1 каталитичен хидроксилазен домен, който катализира превръщането на 5-метилцитозин в 5-хидроксиметилцитозин [14] . Използвайки тази слята молекула TALE-TET1, те показаха, че деметилирането на определени CpG промотори може да доведе до значително повишаване на експресията на съответните човешки гени. Разработването на ензим, базиран на инактивирана молекула dCas9 (неспособна да разрязва ДНК), значително ще опрости създаването на селективни деметилази. Това ще позволи деметилазата да бъде насочена към хиперметилираните генни промотори, избрани за активиране от водещата РНК. [15]
Разработена е среда, която предизвиква хипометилиране на ДНК в клетки in vitro. Тази среда, наречена 2i, съдържа два малки молекулни инхибитора, единият от които инхибира ERK1/2 сигналния път, а другият Gsk3β. Той се използва широко за препрограмиране и поддържане на плурипотентното състояние на клетките [16] [17] .
Промени в метилирането на ДНК с остаряването
Още през 70-те години на миналия век в произведенията на Ванюшин Б.Ф. и редица други служители на Биологическия факултет на Московския държавен университет бешеразкрита е взаимовръзката на етапите на индивидуално развитие и стареене на животни и хора с промени в такава ензимна модификация като метилиране на ДНК [18]. За поредицата от трудове "ДНК метилиране - епигенетичен контрол върху генетичните функции на тялото" Ванюшин Б.Ф. Присъдена е наградата А. Н. Белозерски.
В процеса на стареене на човешкия организъм функционалният потенциал на хематопоетичните стволови клетки (HSC) е значително намален, което допринася за развитието на хемопоетичната патофизиология при възрастните хора [30] . Това свързано с възрастта намаляване на броя на HSCs и тяхната способност за пролиферация, както се оказа, зависи в по-голяма степен не от дължината на теломерите, а от хиперметилирането на ДНК на гените, регулирани от протеините на Polycomb repressor complex 2 [31] .
Според китайски изследователи [32] метилирането на ДНК може да допринесе за здравословното стареене на човека чрез регулиране на гени, податливи на заболявания, свързани с възрастта. Например при болестта на Алцхаймер активно се експресира генът каспаза 3 CASP3, който участва в разцепването на бета-амилоидния прекурсорен протеин 4А, което води до невронална смърт, докато при столетниците генът CASP3 се блокира чрез хиперметилиране на мястото близо до мястото на започване на транскрипцията на този ген. Друг пример: генът на интерлевкиновия рецептор IL1R2 има ниска експресия в случай на атеросклероза, докато при столетниците неговата активност не е намалена поради хипометилирания регион близо до мястото на започване на неговата транскрипция [32] [33] .
Вижте Вижте още:Биологичен часовник (стареене), както и научнопопулярен преглед на български [34] и подробен преглед на английски [35]
Ролята на метилирането в онкогенезата
Установено е, че епигенетичната възраст влияе върху вероятността от рак. Разработен е алгоритъм за изчисляванеепигенетична възраст според метилирането на кръвната ДНК. Алгоритъмът се основава на 71 маркера за метилиране на ДНК, които могат да се променят в зависимост от околната среда, упражненията и диетата на човека. Проучване, използващо този алгоритъм върху колекция от кръвни проби, събрани в продължение на 15 години, показа, че тези с епигенетична възраст приблизително една година по-голяма от тяхната хронологична възраст имат 6% по-висок риск от развитие на рак в рамките на три години, а тези, които са приблизително 2,2 години по-възрастни от тяхната хронологична възраст, имат 17% повишен риск от смърт от рак в рамките на пет години [36] [37] .
Сравнението на данните за генотипа на хората, предразположени към рак, с техния профил на ДНК метилиране предполага, че в около 20% от случаите на наследствен рак се открива връзка между нивото на метилиране на определени локуси и генните полиморфизми, свързани с риска от рак. По-специално, беше наблюдавана силно значима корелация между нивото на CpG метилиране и експресията на ключови ракови гени като MYC, TERT и TP63 [38].
Около една трета от всички солидни тумори са свързани с мутация в гена KRAS или с мутации в свързаните с KRAS пътища. KRAS изключва ензима TET1, който насърчава инактивирането на гена чрез метилиране. TET1 катализира началния етап на активно желязо- и алфа-кетоглутарат-зависимо деметилиране на ДНК при бозайници, превръщането на 5-метилцитозин (5-MC) в 5-хидроксиметилцитозин (5-HMC) чрез окисление на 5-MC. Добавянето на TET1 към тези мутантни клетки активира туморни супресорни гени, което изглежда е достатъчно за намаляване на анормалната пролиферация. Въпреки това е достатъчно да се инактивира TET1, за да се направят тези клетки отново злокачествени, дори без KRAS [39] .
важнобиомаркер на онкогенезата е хиперметилиране на CpG острови вътре в промотора на гена ZNF154 (протеин на цинковия пръст 154) [40] [41] . Хиперметилиране на ZNF154 се наблюдава в по-голямата част от туморните клетки, но липсва в нормалните клетки [42]. Все още не е ясно каква функция изпълнява генът ZNF154 в тялото. Едновременно хипометилиране обикновено се наблюдава в два геномни региона, свързани с Casp8 (каспаза-8) и VHL (туморен супресор на Hippel-Lindau) [42] .
Нивото на метилиране на ДНК в Drosophila melanogaster, любим обект на генетиците, е много ниско, което попречи на изследването му чрез бисулфитни секвениращи методи [43] . Такаяма и др. [44] разработиха високочувствителен метод, който направи възможно откриването, че профилът на метилиране на ДНК последователностите на генома на мухата е много различен от профила на метилиране на човешкия, животинския или растителния геном. Метилирането на генома на Drosophila е концентрирано в определени къси базови последователности (от 5 базови двойки), които са богати на CA и CT, но обеднени на гуанин. Освен това се оказа, че е независим от активността на DNMT2. По-нататъшното изследване на метилирането на ДНК в Drosophila ще помогне да се идентифицират свързаните с възрастта промени в епигенома.
Напоследък има значителен пробив в разбирането на процеса на метилиране на ДНК в растенията, особено варабски > [45] Други ДНК метилтрансферази също присъстват в растенията, но тяхната функция все още не е изяснена (виж [1]). Смята се, че специфичността на метилтрансферазата по време на метилирането на ДНК се модулира от РНК. Специфични РНК транскрипти се транскрибират от определени региони на матрицата – геномна ДНК. Тези РНК транскрипти могат да образуват двойноверижни РНК молекули. Двуверижни РНК, свързани чрез регулаторни сигнални пътищамалки интерфериращи РНК (siRNAs) или микроРНК (miRNAs) определят локализацията на ДНК метилтрансферазите на местата на специфични нуклеотидни последователности в генома [46].