Генетичен апарат и хромозомна репликация
А - фрагмент от ДНК верига, образувана от редуващи се остатъци от дезоксирибоза и фосфорна киселина. Към първия въглероден атом на дезоксирибозата е прикрепена азотна основа: 1 - цитозин; 2 - гуанин; B - двойна спирала на ДНК: D - дезоксирибоза; F - фосфат; А - аденин; Т - тимин; G - гуанин; С - цитозин
Структурата на генетичния апарат на прокариотите отдавна е обект на разгорещени дискусии, чиято същност беше дали те имат същото ядро като еукариотите или не. Установено е, че генетичният материал на прокариотните организми, както и на еукариотните, е представен от ДНК, но има съществени различия в структурната му организация. При прокариотите ДНК е повече или по-малко компактно образувание, което заема определен участък в цитоплазмата и не е отделено от нея с мембрана, както е при еукариотите. За да се подчертаят структурните различия в генетичния апарат на прокариотните и еукариотните клетки, беше предложено да се нарече нуклеоид в първите, за разлика от ядрото във вторите.
Електронното микроскопско наблюдение показва, че прокариотният нуклеоид, въпреки липсата на ядрена мембрана, е доста ясно разграничен от цитоплазмата, заема като правило централна област в нея и е изпълнен с ДНК вериги с диаметър около 2 nm. Не е изключено организацията на прокариотната хромозома, открита в електронния микроскоп, да е силно повлияна от условията на фиксиране на лекарството. Според наличните наблюдения в живата клетка нуклеоидът заема повече място в цитоплазмата.
Цялата генетична информация на прокариотите се съдържа в една ДНК молекула, която има формата на ковалентно затворен пръстен и се нарича бактериална хромозома (В прокариотната клетка ДНК може да се намира и извън бактериалната хромозома - в плазмиди, но последните не са задължително клетъчникомпоненти).
Разгънатата дължина на една молекула може да бъде повече от 1 mm, т.е. почти 1000 пъти дължината на бактериална клетка. Дълго време се смяташе, че не може да се проследи закономерност в разпределението на ДНК нишките на бактериалната хромозома. Въпреки това, ако изхождаме от факта, че ДНК молекулата образува произволна намотка, е трудно да се обясни процесът на репликация и последващото разпределение на образуваните хромозоми между дъщерните клетки. Специални изследвания показват, че прокариотните хромозоми са силно подредена структура със седиментационна константа 1300-2000S за свободната форма и 3200-7000S за мембранно свързаната форма. И в двата случая част от ДНК в тази структура е представена от система от 20–100 независимо суперспирални бримки. РНК молекулите участват в осигуряването на суперспиралната организация на хромозомите.
Репликация на кръговата бактериална хромозома в две посоки
А - родителска ДНК молекула; B - междинни репликативни форми;
C - дъщерни ДНК молекули след завършване на процеса на репликация и дивергенция: 1 - начална точка на репликация; черните стрелки показват посоката на репликация.
Въпреки че всяка прокариотна клетка съдържа 1 хромозома, често в експоненциално растяща култура, количеството ДНК на клетка може да достигне маса от 3, 4, 8 или повече хромозоми. Често в клетките под въздействието на определени фактори (температура, pH на околната среда, йонизиращо лъчение, соли на тежки метали, някои антибиотици и др.) Настъпва образуването на много копия на хромозомата. Когато се елиминира влиянието на тези фактори, както и след прехода към стационарната фаза, по правило в клетките се намира едно копие на хромозомата.
Прокариотната ДНК е изградена по същия начин като еукариотната (фиг. 14).Молекулата на ДНК носи много отрицателни заряди, тъй като всеки фосфатен остатък съдържа йонизирана хидроксилна група. При еукариотите отрицателните заряди се неутрализират чрез образуване на ДНК комплекс с основните протеини - хистони. Хистоните не са открити в клетките на по-голямата част от прокариотите, следователно неутрализацията на заряда се извършва чрез взаимодействие на ДНК с полиамини (спермин и спермидин), както и с Mg 2+ йони. Напоследък хистони и хистоноподобни протеини, свързани с ДНК, са открити в някои архебактерии и цианобактерии. Съдържанието на A + T и G + C базови двойки в ДНК молекулата е постоянно за даден тип организъм и служи като важен диагностичен признак. При прокариотите моларната фракция на GC в ДНК варира в много широк диапазон: от 23 до 75%.
Механизъм на разпределение на бактериалните хромозоми
А - бактериална клетка съдържа частично репликирана хромозома, прикрепена към мембраната в точката (или точките) на репликация.
B - хромозомната репликация е завършена. Бактериалната клетка има две дъщерни хромозоми, всяка от които е прикрепена към CMP. Показан е синтезът на клетъчната стена и CPM.
B - продължаващият синтез на мембраната и клетъчната стена води до разделяне на дъщерни хромозоми. Показано е началото на клетъчното делене чрез образуване на напречна преграда: 1 - ДНК; 2 - прикрепване на хромозомата към CPM: 3 - CPM; 4 - клетъчна стена: 5 - синтезирана зона на CPM; 6 — нов материал на клетъчната стена.
Разделянето на ДНК молекулата (репликацията) става по полуконсервативен механизъм и обикновено винаги предхожда клетъчното делене. С помощта на електронен микроскоп беше установено, че репликацията на ДНК започва в точката на прикрепване на кръговата хромозома към CPM, където е локализиран ензимният апарат, отговорен за репликацията. Можете честоза да открият, че контактът на ДНК с CPM се осъществява чрез мезозоми. Репликацията, започнала в точката на прикрепване, след това продължава в две противоположни посоки, образувайки междинни структури, характерни за пръстенната хромозома (фиг. 15).
Получените дъщерни хромозоми остават прикрепени към мембраната. Репликацията на ДНК молекулите се извършва успоредно с мембранния синтез в областта на контакта на ДНК с CMP. Това води до разделяне (сегрегация) на дъщерни ДНК молекули и образуване на изолирани хромозоми (фиг. 16).
Моделът на структурата на бактериалната хромозома трябва също да обясни процесите на транскрипция и транслация в клетката. Съгласно съществуващите концепции суперспиралните бримки съответстват на неактивни в момента ДНК региони и са разположени в центъра на нуклеоида. По периферията му има деспирализирани области, където се синтезира информационна РНК (иРНК), докато, тъй като процесите на транскрипция и транслация в бактериите протичат едновременно, една и съща молекула на иРНК може да бъде едновременно свързана с ДНК и рибозоми (фиг. 17).
Модел на нуклеоидна организация на E. coli
1 - външна мембрана на клетъчната стена; 2 - пептидогликанов слой; 3 - CPM; 4 - точка на прикрепване на бактериалната хромозома към CPM; 5 - рибозоми, "седнали" на иРНК.
Растеж и методи на размножаване
Растежът на прокариотната клетка се разбира като координирано увеличаване на количеството на всички химични компоненти, от които е изградена. Растежът е резултат от много координирани биосинтетични процеси, които са под строг регулаторен контрол и води до увеличаване на масата (и следователно размера) на клетката. Но клетъчният растеж не е неограничен. След достигане на определен (критичен) размер клетката се дели.
По-голямата част от прокариотите се характеризират с еднакво по размер бинарно напречно делене, което води до образуването на две идентични дъщерни клетки. При този метод на разделяне има симетрия по отношение на надлъжната и напречната ос. В повечето грам-положителни еубактерии и нишковидни цианобактерии, разделянето става чрез синтеза на напречна преграда, простираща се от периферията към центъра (фиг. 18, А).
Така при Bacillus subtilis в средата на клетката първо се появява пръстеновидна изпъкналост на CPM, придружена от образуването на мезозоми с различен вид. Те се образуват на мястото на напречните прегради и се предполага, че участват активно в синтеза на пептидогликан и други компоненти на клетъчната стена. Напречната преграда се формира от CPM и пептидогликановия слой, външните му слоеве се синтезират по-късно. Клетките на повечето грам-отрицателни еубактерии се делят чрез свиване. При Е. coli на мястото на делене се установява постепенно нарастваща и насочена навътре кривина на СРМ и клетъчната стена (фиг. 18; 5). Синтезът на нова клетъчна стена може да се случи на няколко места или само в зоната на образуване на напречната преграда (фиг. 18, A, B).
Вариант на двойното делене е пъпкуването, което може да се разглежда като неравномерно двойно делене. При пъпкуването на един от полюсите на майчината клетка се образува малък израстък (пъпка), който се увеличава в процеса на растеж. Постепенно бъбрекът достига размера на майчината клетка, след което се отделя от последната. Клетъчната стена на бъбрека се синтезира напълно наново (фиг. 18, С).
В процеса на бутонизация се наблюдава симетрия само по отношение на надлъжната ос. При еднакво бинарно делене майчината клетка, като се дели, поражда две дъщерни клетки и самата такаватака изчезва. При пъпкуването майчината клетка поражда дъщерна клетка, като в повечето случаи между тях могат да се открият морфологични и физиологични различия: има стара майчина клетка и нова дъщерна клетка. В този случай може да се наблюдава процесът на стареене.
По този начин, за някои щамове на Rhodomicrobium е доказано, че майчината клетка е способна да пъпкува не повече от 4 дъщерни клетки. Дъщерните клетки се адаптират по-добре към променящите се условия. Пъпкуването е открито в различни групи прокариоти: сред фото- и хемотрофи, които извършват авто- и хетеротрофен конструктивен метаболизъм. Вероятно е възниквал няколко пъти в хода на еволюцията.
Методи за делене и синтез на клетъчна стена при прокариоти
И — разделяне чрез образуване на кръстосана преграда;
B - разделяне чрез стеснение;
D - множествено деление: 1 - клетъчна стена (дебелата линия показва клетъчната стена на майчината клетка, тънката линия - новосинтезирана); 2 - CPM; 3 - мембранна структура; 4 - цитоплазма, в центъра на която се намира нуклеоидът; 5 - допълнителен фибриларен слой на клетъчната стена.
Бинарното делене може да се случи в една или повече равнини. В първия случай, ако клетките не се разпръснат след делене, това води до образуването на вериги от пръчковидни или сферични клетки, във втория случай - до клетъчни клъстери с различна форма (виж фиг. 1; 4-6). Дивергенцията на получените дъщерни клетки възниква в резултат на лизис на средния слой на клетъчната стена.
За една група едноклетъчни цианобактерии е описано размножаване чрез многократно делене. Започва с предварителната репликация на хромозомата и увеличаване на размера на вегетативната клетка, която след това претърпява серия от бързи последователни бинарни деления, които се случватвътре в допълнителния фибриларен слой на майчината клетъчна стена. Това води до образуването на малки клетки, наречени беоцити 12, чийто брой при различните видове варира от 4 до 1000. Освобождаването на беоцитите става чрез разкъсване на стената на майчината клетка (фиг. 20, D). По този начин основата на множественото деление е принципът на равното двоично деление. Разликата се състои в това, че в този случай след бинарно делене получените дъщерни клетки не растат, а отново се разделят.
Разделянето на прокариотна клетка започва, като правило, известно време след завършване на цикъла на репликация на ДНК. Вероятно репликацията на бактериалната хромозома задейства някои процеси, водещи до клетъчно делене. По-детайлното изследване на връзката между репликацията на ДНК и клетъчното делене при различни видове прокариоти не доведе до недвусмислени резултати. Получени са данни, че сигналът за клетъчното делене е началото на репликацията на ДНК, нейното завършване или репликацията на специфичен локус на бактериалната хромозома. По този начин обикновено има добре дефинирана времева връзка между хромозомната репликация и деленето на бактериалните клетки. Излагането на различни химикали и физични фактори, водещи до потискане на репликацията на ДНК, спира и деленето на клетките. Въпреки това, при определени условия, връзката между двата процеса може да бъде прекъсната и клетките са способни да се делят при липса на синтез на ДНК. Това е постигнато чрез въвеждане на определени мутации в генетичния апарат на бактериална клетка.
Възможно е също да се наруши последователността от процеси на репликация на бактериална хромозома и клетъчно делене чрез отглеждане на бактерии при различни температури.
Култивиране на Bacillus subtilis върху богатахранителна среда при 37 ° води до интензивно делене на бактериалната хромозома и клетъчен растеж, което води до образуването на нишковидни клетки в култура, съдържаща много хромозомни копия с напълно липсващи или недостатъчно оформени (отворени) напречни прегради. Когато скоростта на растеж се забави, се наблюдава нишковидно клетъчно делене, което води до образуването на бактериални клетки с нормална дължина.