Хаплоидна тъканна култура
Хаплоидията е такова намаляване на броя на хромозомите, при което в половин набор от соматични и зародишни клетки всяка двойка хомоложни хромозоми е представена само от една от тях. Хаплоид или моноплоид е организъм, който има хаплоиден набор от нехомоложни хромозоми в соматичните клетки.
Спонтанната поява на хаплоиди е много ниска, приблизително един хаплоид на 10 5-10 6 растения. За увеличаване на честотата на образуване на хаплоиди се използват различни методи: - въздействат върху процесите на опрашване и оплождане чрез радиация или химикали; - растенията се опрашват с чужд прашец, което предизвиква развитието на неоплодено яйце; - отдалечените кръстове се извършват с такива генотипове, когато е осигурено двойно оплождане, но в процеса на развитие на ембриона хромозомите на опрашителя се елиминират, което води до развитието на хаплоиден ембрион на генотипа на майката (метод на хаплопродуцент); - изолирани прашници се култивират; - култивират се неоплодени яйчници и яйцеклетки.
Хаплоидният генотип има характерни черти. Хаплоидите имат рецесивни гени. На външен вид хаплоидите са подобни на съответните диплоиди, но по-малки от тях. Хаплоидните клетки са по-малки от диплоидните клетки. Хаплоидите не образуват пълни гамети. Чрез удвояване на броя на хромозомите на соматичните клетки на хаплоида може да се получи напълно хомозиготно диплоидно растение.
Хаплоидите се получават с помощта на хаплопроизводители (дистанционна хибридизация), партеногенеза. Хаплоиди могат да бъдат получени в тъканна култура от прашници и клетки на ембрионалната торбичка; хаплоиди в тъканна култура вече са получени от 200 вида растения.
Дистанционната хибридизация е важен метод за оформяне и подобряване на съществуващи сортове. Основеннейният проблем е ниска съвместимост или пълна несъвместимост на кръстосани видове. За преодоляването му са ефективни различни модификации на методите за тъканни култури: навременно изолиране и отглеждане на хибридни ембриони върху хранителни среди; калусогенеза по време на култивиране на незрели хибридни ембриони и регенерация на растения от калусни тъкани.
прашникова култура
Има няколко известни метода за създаване на хаплоиди в културата на изолирани растителни тъкани, които имат своите предимства и недостатъци: 1) използване (въвеждане в култура) на хаплоидни тъкани на местно растение (прашници, поленови зърна, яйцеклетки); 2) хаплопродукция - създаване на условия за получаване на хаплоидна тъкан върху непокътнато растение (дистанционна хибридизация, водеща до елиминиране (аборт) на един от родителските генотипове) и след това отглеждане на недоразвито семе или ембрион.
Гут и Магешвари, които първи култивират прашници, индуцират растежа на хаплоидни клетки чрез действието на кинетин и растежа на диплоидни клетки чрез включването на ауксин, индолоцетна киселина (IAA) с кинетин, в средата.
В процеса на култивиране на прашника в in vitro условия се извършва андрогенеза - развитие на ембриоиди, а след това и растения от мъжки зародишни клетки (микроспори).
За повечето растения оптималното време за засаждане на прашници върху хранителни среди е етапът на "средни" или "късни" мононуклеарни вакуолизирани микроспори. На този етап микроспорите се освобождават от тетрадите и се подготвят за първата митоза.
За култивиране на прашници се използват среди: Murashige-Skoog с 1/2 концентрация на сол, китайска среда, среда с екстракт от картофи, среда на Nitsch. Ауксините или не се добавят изобщо, или се използва 2,4-D. От цитокинините се използват кинетин и 6-BAP. агар агар внимателноизмит, тъй като съдържа вещества, които влияят неблагоприятно върху развитието на прашниците. За адсорбцията на метаболити, които инхибират процесите на растеж в тъканната култура, към хранителните среди се добавя активен въглен.
Преди култивирането прашниците се държат при температура 4-6 С в продължение на 2-8 дни. Изолираните прашници се култивират на тъмно или при слаба светлина при температура (25 + 2) C.
Върху хранителни среди микроспорите могат да образуват калус или хаплоиден ембрион (първо се образува 40-50-клетъчен проембрион). Ембрионът в глобуларния стадий прекъсва екзината и преминава през етапи, подобни на развитието на зиготичния ембрион. Поленът се дели, клетките се увеличават, екзината се разкъсва и се образува калус, върху който чрез промяна на съотношението на фитохормоните могат да се получат хаплоидни ембриоиди. Получаването на хаплоиди чрез биотехнологични методи ви позволява бързо да създавате хомозиготни линии, което прави тази технология много ценна за развъждане и генетика.
В процеса на култивиране на изолирани прашници върху хранителни среди, развитието протича по два начина: или чрез директна андрогенеза (образуване на ембриоиди и хаплоидни регенерирани растения) (фиг. 4.16), или чрез индиректна андрогенеза, когато репродуктивните клетки се дедиференцират и преминават към пролиферация, образувайки първо калус, а след това, когато се предават на специална среда, морфогенен калус и регенерирани растения.
Регенерираните издънки, получени от поленовите кали, са разнородни по редица морфологични признаци. Това се дължи на хетерогенността на калусите. Поради това е необходимо да се проведе цитологично изследване както на калусите, така и на регенерираните растения.
Както показват експериментите, по този начин се образуват не само хаплоидни, но и диплоидни и полиплоидни растения. Първите се образуват от микроспори илимикроспори от калус, а диплоиди - от спонтанно удвоени ядра, от хаплоидни калусни клетки.
Зелевите прашници реагират благоприятно на смес от кинетин и 2,4-D, оризовите прашници на 2,4-D или 1-нафтилоцетна киселина (NAA). Изключително активен растеж на цветен прашец се предизвиква при датура и род Brassica от кокосово мляко, а при датура от сок от сливи. Тези продукти се оказаха по-ефективни за тези растения от всички синтетични индуктори.
При много видове най-добрият добив на микроспори се осигурява чрез предварителна обработка на култивирани прашници с ниски температури. При ечемика, например, третирането в продължение на 7-14 дни при 7°C дава оптимални резултати.
Използването на хаплопродуценти и далечна хибридизация за получаване на хаплоидни тъкани
Дистанционната хибридизация е важен метод за оформяне и подобряване на съществуващи сортове. Основният му проблем е ниската съвместимост или пълната несъвместимост на кръстосаните видове. За преодоляването му са ефективни различни модификации на методите за тъканни култури: навременно изолиране и отглеждане на хибридни ембриони върху хранителни среди; калусогенеза по време на култивиране на незрели хибридни ембриони и регенерация на растения от калусни тъкани.
Недостатъците на отдалечената хибридизация могат да бъдат превърнати в предимства и използвани за положителни цели, например за получаване на хаплоидни тъкани. Факт е, че при отдалечена хибридизация много често се образува по-нисък (хаплоиден) потомък, тъй като генотипът на една от родителските форми често не се слива с друг родителски геном и се прекъсва.
В резултат на това се образува хаплоидна клетка и ембрионът, който се развива от нея, се оказва крехък, неосъществен, не много способен да образува пълноценно растение, което може да се коригира с помощта натъканни култури.
За ечемика успешно се използва методът на хаплопродукция, основан на междувидова хибридизация на култивиран ечемик (H. vulgare) с луковичен - H. bulbosum.
Показани са предимствата на този метод в сравнение с културата на прашника. Редица фактори оказват значително влияние върху ефективността на хаплопродукцията: генотипът на първоначалните форми, степента на диференциация на незрелите хибридни ембриони, третирането на хибридни уши с разтвори на физиологично активни вещества, времето на засяване и опрашване на първоначалните форми, съставът на хранителните среди за отглеждане на ембриони, методите на колхицин и др.
Сортовете и линиите на пролетна и зимна пшеница служат като майчини форми за получаване на житни хаплоиди T. timopheevi, T. militinae, T. tuigidum, T. dicoccum, овес Ae. ovata, Ae. triaristata, памирска ръж и др. - източници на комплексна устойчивост на болести и абиотични стресове, високо съдържание на протеини. В зависимост от комбинацията настройката на зърната варира от 0 до 66,4%. In vitro, от 5 до 100% от ембрионите покълват, регенерацията на зелените растения варира от 5 до 93,8%. Използването на такива подходи е ефективен инструмент за обогатяване на генофонда на култивираните растения и създаване на нови сортове.
Дихаплоидите на трапезните картофи се получават чрез опрашване на сортове с цветен прашец от примитивни култивирани диплоидни видове, способни да индуцират хаплопартеногенеза. Формите със спонтанно удвоени набори от хромозоми и експресирани благоприятни гени се избират от прашеца на получените дихаплоиди в културата на микроспори, които след това се кръстосват по двойки един с друг. Слети протопласти на хибриди, които комбинират благоприятни гени, дават тетраплоиди с даден генотип.
Установени са някои причини за нежизнеспособността на хибридните семена. Успешно развитие на тези произведения бешеизползване на метода за култивиране на ембриони за повишаване на ефективността на дистанционната хибридизация.
За получаване на хаплоидни тъкани на плодородни регенеранти в културата се въвежда допълнителен етап - удвояване на хромозомите.
Използват се колхицин, антибиотици, обезглавяване (отрязване) на върховете за удвояване на броя на хаплоидните хромозоми (диплоидизация); често се наблюдава самоудвояване в калусната култура по време на ендомитоза. Получените диплоидни клетки „запушват“ хаплоидни и анеуплоидни клетки поради по-енергично делене и растеж. Растенията, регенерирани от такива клетки и тъкани, се наричат дихаплоиди.
Възможности на хаплоидните технологии
Хаплоидните растения са от интерес за генетиката и развъждането, тъй като всеки ген в хаплоид е представен от един алел, а рецесивните алели в такива растения се появяват заедно с доминантните. Хаплоидният фенотип напълно отразява техния генотип, така че сред такива растения е удобно да се избират форми с ценни мутации.
Хаплоидната технология, дистанционната хибридизация, последвана от култура на ембриони, клетъчната селекция, клоновото микроразмножаване, базирано на култивиране на клетки, тъкани и органи, вече имат реален принос в селекцията на растенията.
Хаплоидните технологии значително разширяват възможностите за селекция. Основното предимство на отглеждането на растения от прашец е бързото създаване на чисти линии, което е особено важно за двудомните видове и облигатните кръстоски. За планираните кръстоски развъдчиците могат да поддържат родителските форми в тъканна култура вегетативно. При развъждане за хетерозис, създаването на линии не изисква няколко години инбридинг.
Култивирането на хаплоиди in vitro прави възможно получаването на хомозиготни постоянни линии от хетеротични хибридни популации за кратко време и по този начин ускорява селекцията.положителни опции. Възможно е да се оценят обещаващи популации в ранните етапи на процеса на размножаване.
Освен това хаплоидните клетки са удобни за решаване на много теоретични проблеми и за манипулации на генното инженерство. От изследването на хаплоидни клетъчни линии генетиците се надяват да получат по-точни данни за природата на генните мутации и цитоплазменото наследство.