Химико-токсикологичен анализ на лекарствени вещества в кръвта (плазма, серум) по метода

Библиографско описание:Анализ чрез високоефективна течна хроматография на лекарствени вещества в кръвта (плазма, серум) / Крупина Н.А., Краснова Р.Р., Пашовкина Р.Н. // Мат. VI Всеруски. конгрес на съдебните лекари. - М.-Тюмен, 2005.

код за вграждане във форума:

Показана е възможността за използване на метода на високоефективната течна хроматография за скрининг и количествено определяне на лекарства в кръвта. Предложени са условия за изолиране на лекарствени вещества от 0,5 ml кръв.

Ключови думи: високоефективна течна хроматография, вътрешен стандарт, течна течна екстракция.

Понастоящем злоупотребата с лекарства и използването на лечебни коктейли, които включват няколко лекарствени вещества от различни фармакологични групи, станаха широко разпространени. Дозата на всяко от приетите вещества може да не достигне токсични концентрации, но вероятността от случайни и умишлени интоксикации се увеличава, което често води до смърт в резултат на фармакологични взаимодействия [1]. В тази връзка значението на избора на метод за изолиране и метод за откриване в съдебно-химическо изследване за "неизвестно" вещество нараства драстично. Освен това е необходимо да изберете правилния обект за изследване, неговото измерение, да идентифицирате извлеченото вещество с висока чувствителност, специфичност и да извършите количественото му определяне. Количественото определяне ви позволява правилно да интерпретирате получените аналитични резултати и да установите дали е ималов този случай отравяне.

Съвременната високоефективна течна хроматография е един от ефективните методи за разделяне на сложни смеси на отделни компоненти и извършване на качествен и количествен анализ на компонентите на сместа, която се разделя. В края на 2003 г. за лабораторията е закупен високоефективен течен хроматограф Agilent 1100 с диодно-матричен детектор (DMD). При използване на DMD пробата се сканира на всеки няколко милисекунди, т.е. спектралната информация се издава почти постоянно. Диодната матрица постоянно регистрира сигнали в ултравиолетовата и видимата част на спектъра, като по този начин осигурява запис на UV - B - спектри в режим на сканиране. Това прави възможно непрекъснатото записване, при висока чувствителност, на неизкривени спектри на компоненти, бързо преминаващи през спектралната клетка. Данните, получени от UV детектора едновременно при различни дължини на вълната, се обработват и оценяват с помощта на софтуер, който търси в спектралната библиотека, извлича сигнала при определена дължина на вълната, за да подобри селективността, изважда фона и извършва други операции. Софтуерът може да се използва за автоматична проверка на UV спектри спрямо известни, идентифициране на компоненти и проверка за "чистота" на пиковете чрез сравняване на спектрите, записани в началото и края на всеки пиков изход. Тази автоматизирана система за проследяване е идеална за скрининг, тъй като позволява само "подозрителни" пикове да бъдат избрани за по-нататъшен анализ.

Целта на нашето изследване беше да изберем оптималните условия за изолиране на лекарства от кръвта (плазма, серум), хроматографски скрининг на лекарства и тяхното едновременно количествено определяне с помощта на вътрешенстандартен.

След като проучихме чуждестранна литература относно методите за изолиране на лекарства от биопроби с по-нататъшното им изследване чрез HPLC [7], ние се спряхме на метода (с някои модификации), който се използва от LNS Toxicologie (Химико-токсикологична лаборатория на Люксембург).

Създадохме и база данни за лекарствени субстанции, която включва библиотека от UV - спектри на субстанции, техните абсолютни и относителни (спрямо стандарта) [2] времена на задържане.

експериментална част

Основата на метода. Вещества от кръв, серум, плазма се екстрахират с помощта на течност - течна екстракция със смес от n - хексан - дихлорометан - изо - пропанол при pH 9,5. Екстрактите се анализират от детектор с диодна матрица (DAD) в градиентен режим. Веществата се откриват чрез времена на задържане и UV спектри на веществата. Количественото определяне се извършва с вътрешен стандарт 5 - (4 - Метилфенил) - 5 - фенилхидантоин (MPPH).
Изследователски обекти. Обекти на изследване са кръв, серум, плазма. Проведени са моделни проучвания върху плазма без лекарства, получена от отдела за кръвопреливане на MONIKI на името на A.I. М. Ф. Владимирски. Като реални обекти използвахме кръв, серум от живи индивиди и кръв от трупове, постъпващи в отделението за изследване.
Реагенти. Амонячен буфер pH 9,5, наситен разтвор на амониев сулфат, n - хексан, дихлорометан, изо - пропанол, ацетонитрил за HPLC, MPPH, 85% о-фосфорна киселина, монокалиев фосфат (Merck), стандартни разтвори на вещества (смес): кофеин, фенобарбитал, дифенхидрамин, MPPH, феназепам в концентрация 1 0 μg / ml.
Инструменти и аксесоари. Течен хроматограф с диодна матрицаДетектор Agilent 1100, шейкър (тип хоризонтално разклащане) 300 вибрации/мин, центрофуга Joan 4000 rpm, концентратор за екстракт от термоблок, pH Checker, pH метър (pH 211 модификации), водоструйна помпа, пипети с променлив обем 100-1000 µl и 10-100 m cl с накрайници за еднократна употреба, устройство за филтриране подвижната фаза.
Условия за откриване и дефиниране. Изследването е проведено на течен хроматограф Agilent 1100 с диоден детектор в градиентен режим.

Колона: ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6 x 150 mm, 5 µm;
Предпазна колона ZORBAX SB – C18 4.6 x 12.5 mm, 5 µm
Температура на колонния термостат 30 0 C
Елуент A: дейонизирана вода
Елуент В: Ацетонитрил HPLC градиент
Елуент D: Фосфатен буфер рН 3.8
Градиент:

Време (мин)	%IN	%Д
0	15	85
8	35	65
17	65	35
21	65	20
26	15	20
7-0	15	85

Скорост на потока: 1ml/min; от 7 – 0 минути кондициониране.
Дължина на вълната: 220 nm. Инжекционен обем: 40 µl.

Стандартни решения. Стандартни разтвори на вещества и вътрешен стандарт с концентрация 1 mg / ml в метанол, приготвени по гравиметричен метод от стандарти на вещества, чиято чистота е потвърдена чрез хроматография-масспектрометрия.

Разтвори за калибриране.Пробите за калибриране се приготвят от стандартни разтвори (1mg/ml), като се вземат предвид терапевтичните, токсични и летални концентрации на вещества в кръвта (C mg/l)[4]. Концентрациите на калибровъчните разтвори и линейността са представени в табл. 1.

Концентрация на вътрешен стандарт (MPPH) 10 µg/ml.

Концентрация на калибровъчни разтвори и линейност.

вещество	C1	C2	C3	C4	C5	Линейност (mg/l)
Амитриптилин	0,2	0,5	1.0	2.0	5.0	0,2 - 5,0
Диазепам	0,1	0,5	1.0	5.0	0,1 - 5,0
пропранолол	0,05	0,5	2.0	5.0	0,05 - 5,0
Феназепам	0,05	0,1	0,5	1.0	2.0	0,05 - 2,0
Фенобарбитал	5.0	10.0	20.0	50,0	100,0	5,0 - 100,0

Калибриране.Инструментът използва софтуера ChemStation за автоматично интегриране на пиковете и генериране на калибрационна крива от таблицата за калибриране.

0,5 ml празна плазма се поставя в стъклена епруветка от 12 ml, добавят се 50 µl (2 проби) от всяка концентрация на калибриращи разтвори на вещества, смесват се старателно и след това се вливат в продължение на 5 минути за разпределение в плазмата. Добавете 50 µl MPPH (вътрешен стандарт) при концентрация 10 µg/ml, разбъркайте старателно, 0,5 ml наситен разтвор на амониев сулфат, 0,5 ml амониев буфер (рН 9,5), Екстрахирайте за 5 минути на шейкър (300 col/min) с 5 ml n-хексан-дихлорометан-изопропанол (60:40:2). ), центрофугирани за 3 минути при 4000 rpm. Органичната фаза се поставя във флакон от 4 ml и се изпарява при температура 40°СC. Сухият остатък се разтваря в 100 ul от подвижната фаза (15% ацетонитрил и 85% фосфатен буфер рН 3.8) и се разклаща за няколко секунди на IKA минишейкър (2000/min), 40 ul се инжектират в HPLC. Успоредно с това при горните условия беше извършено извличане и изследване на празна плазма.

Анализ на тестовия обект.0,5 ml от тестовата кръв (серум) се поставят в стъклена епруветка от 12 ml, добавят се 50 μl MPPH вътрешен стандарт с концентрация 10 μg/ml и се смесват. Освен това, той беше анализиран по същия начин, както е описано по-горе. Предварително се въвежда стандартна смес от вещества: кофеин, фенобарбитал, дифенхидрамин, MPPH, феназепам в концентрация 10 µg/ml.

Фиг.1. Стандартна смес от вещества (80 ng вещества в инжектираната проба)

Идентифицирането на лекарствените вещества се извършва чрез времена на задържане и библиотека от UV - спектри.

Създадената база данни включва следните лекарствени вещества.

Амидопирин, амитриптилин, хлорпромазин, аналжин, атенолол, атропин, верапамил, халоперидол, грандион, диазепам, дибазол, диклофенак, дифенхидрамин, карбамазепин, клозапин, кломипрамин, клонидин, кордиамин, квойан, кломипромозен, клонидин, кофин, кофин, кломипрамин, клонидин, кордиамин, кофеин, левомен, хлонидин, кофин, кофин, кофин, кофин, клоницин, корбамин, кофин, кломипрамин, клонидин, кордиамин. В, Nitrazepam, Novoca in, Nordazepam, но - SHPA, оксазепам, папаверин, парацетамол, пропранолол, тиопентален, тиоридазин, трифазин, феназепам, фенацетин, фенитоин, фенобарбита, фтивазид, хлоразепат, хлордиазиазоксид, циклиназид, хлоразет, etaminal. За някои от тези вещества са определени граници на откриване, определяне, % добив [6] и е извършена статистическа обработка [3, 5].

Резултати

Използвайки предложения метод, добивът на основни лекарства в кръвта варира от 52,2 до 77%. (амитриптилин при C = 0,01 и 0,05 mg/l добив 58 и 54,2%съответно; дифенхидрамин при С = 0.025; 0,2; 10.0 mg/l добив 77; 58,3; съответно 70%; диазепам при С = 0,1 и 1,0 mg/l добив съответно 54,1 и 53,2%; пропранолол при С = 0.05; 1.0; 5.0 mg/l добив 57.1; 53,4; съответно 70%; феназепам при C = 0.1; 0,5; 1,0 mg/l добив 61,3; 57; съответно 52,2%. Изходът за фенобарбитал при C = 20,0 и 100,0 mg/l е съответно 16,5 и 15%. Границите на откриване и определяне са съответно: 10 ng/ml; и 50 ng/ml (амитриптилин); 20 ng/ml и 100 ng/ml (диазепам). 25 ng/ml и 100 ng/ml (дифенхидрамин); 10 ng/ml и 50 ng/ml (пропранолол); 30 ng/ml и 80 ng/ml (феназепам); 0,5 µg/ml и 2,0 µg/ml (фенобарбитал)).

Статистическата обработка на резултатите(хi - индивидуален резултат, `Х - средно аритметично; S - стандартно отклонение; RSD (%) - относително стандартно отклонение; Р - вероятност; Δ`Х - доверителен интервал) е представена в табл. 2.

Таблица 2 Статистическа обработка на резултатите.

Назовете вещества	xi	Метрологични характеристики на метода
Амитриптилин

`Х =0.04 `Х =0.0473 S = 0.003 RSD (%) =6.4 Δ`Х = ± 0.006 Р =0.99 (`Х ± Δ`Х) = 0.041 - 0.053