| Приоритети: | Употреба: в медицината, в клиничната биохимия. Цел: подобряване на точността на метода. Същността на изобретението: 0,1 - 0,4 М литиев перхлорат във физиологичен разтвор се използва за депротеинизация при използване на глюкозооксидаза-пероксидаза за определяне на глюкоза. Положителен ефект: прилагането на метода позволява да се повиши точността на метода с 4%. 5 табл.
Чертежи към патент България 2018836
Изобретението се отнася до медицината, по-специално до клиничната биохимия, и може да се използва в медицинската практика при изследване на биохимичните показатели на кръвта в клиниката и експеримента.
Известни методи за депротеинизация на кръвта при ензимно определяне на глюкоза, включително използването на утаяващи реагенти: цинков хидроксид, перхлорна киселина или трихлороцетна киселина.
Всички тези методи обаче са неудобни (трудоемки) от гледна точка на практическо приложение за масови анализи. Когато се използва цинков хидроксид, утаяването на образувани елементи и протеини от цяла кръв се извършва в слабо алкална среда, което осигурява специфичността на ензимната реакция и доста висока точност на определяне на глюкозата, но изисква използването само на прясно приготвен реагент (т.е. суспензия от цинков хидроксид се приготвя във всяка епруветка непосредствено преди вземане на кръвна проба, източване на разтворитецинков сулфат и натриев хидроксид). При използване на перхлорна и трихлороцетна киселина, поради неблагоприятното въздействие на киселата среда върху ензимната реакция, за да се осигури достатъчна точност при определянето на глюкозата, е необходимо да се въведе допълнителна стъпка за довеждане на рН на реакционната смес до стойности от 7,0-8,4.
Най-близкото техническо решение до изобретението е метод за депротеинизация на цяла капилярна кръв с използване на 0,0037 М разтвор на уранил ацетат като утаяващ реагент, който практически не влияе на рН на средата и не изисква специална подготовка.
Въпреки това, този метод не осигурява достатъчно висока точност при използване на определяне на глюкоза с глюкозооксидаза-пероксидаза. В допълнение, уранил ацетатът е радиоактивен и труднодостъпен реагент и точността на определяне на глюкозата при използването му значително зависи от състава на ензимната система.
Целта на изобретението е да се подобри точността на определяне на глюкоза.
Тази цел се постига чрез метода за депротеинизация на цяла капилярна кръв при ензимно определяне на глюкоза, включващ добавяне на реагент за утаяване на кръвни клетки и отделяне на утайката, докато 0,1-0,4 М литиев перхлорат във физиологичен разтвор се използва като реагент.
Разтворът на литиев перхлорат не влияе на pH на средата, стабилен е за три месеца съхранение при 4-8 ° C и за един месец при стайна температура, няма инхибиторен ефект върху ензимните системи за определяне на глюкоза, включително ензимния реагент от Lachema, Labsystems и използван в местната клинична практика.
ПРИМЕР 1. Определяне на глюкоза в серуми с известна концентрация в присъствието на депротеинизиращ реагент.
Към 20 µl серум, съдържащ известна концентрация на глюкоза (5,2 mM), добавете 200 µl от депротеинизиращ реагент (0,2 M литиев перхлорат в 0,9% разтвор на NaCl или 0,0037 M разтвор на уранил ацетат, или суспензия: 200 µl от 0,45% цинков сулфат, смесен с 40 µl от 0. 1 М NaOH, или 0.33 М разтвор на перхлорна киселина), след това се разбърква, суспензията се центрофугира при 15000 rpm за 6 или 15-20 минути при 5000-6000 rpm (утайката трябва да е гъста). След това 1000 µl от ензимен реагент, препоръчан за домашна клинична практика, състоящ се от глюкозооксидаза 18 U/ml, пероксидаза 1 U/ml, 4-аминоантипирин 0,72 mM, фенол 11 mM, фосфатен буфер pH 7,0, се добавя към 100 µl от супернатантата, смесва се и сместа се инкубира при стайна температура за 40 мин. В същото време 10 mM разтвор на глюкоза (референтен) се третира по същия начин. След инкубиране, оптичната плътност А на пробата и стандарта се измерва спрямо контролния разтвор и концентрацията на глюкоза в пробата се изчислява по формулата: глюкоза mM = 10 ..
Резултатите са показани в табл.1.
Както се вижда от табл. 1, при определяне на глюкоза в контролен серум, най-точните резултати са получени при използване на литиев перхлорат като депротеинизиращ реагент.
PRI mme R 2. Оценка на възпроизводимостта на определянето на глюкоза по предложения метод.
Определянето на съдържанието на глюкоза се извършва в един референтен разтвор на глюкоза с концентрация 10 mM (референтният разтвор се приготвя в 0,2% бензоена киселина от глюкоза, изсушена до постоянно тегло при 37 ° C) дневно в продължение на 10 дни, подобно на описаното в пример 1. Въз основа на анализа се изчислява средноаритметичното, стандартното отклонение S и коефициентът на вариация V. Резултатите са представени в таблица 2.
Както се вижда от таблица 2,коефициентът на вариация за литиев перхлорат не надвишава 4%, докато за уранил ацетат тази стойност е 8%, което показва по-висока точност на предложения метод за определяне на глюкоза.
ПРИМЕР 3. Определяне на съдържанието на глюкоза в цяла капилярна кръв на здрави индивиди и пациенти със захарен диабет.
Към 200 µl от депротеинизиращия реагент (вижте пример 1) добавете 20 µl цяла капилярна кръв (за определяне на глюкозата кръвните проби се вземат директно от пръста), смесват се и се центрофугират. По-нататъшното определяне се извършва подобно на това, описано в пример 1. Резултатите са представени в таблица.3.
PRI mme R 4. Определяне на глюкоза в една част от цяла кръв чрез различни методи на глюкозооксидаза-пероксидаза.
Определянето на глюкозата се извършва в една порция цяла венозна кръв, към която се добавя 3,8% разтвор на натриев цитрат (1 част разтвор на натриев цитрат и 9 обемни части кръв), за да се предотврати съсирването, смесено. Добавете 200 µl разтвор на депротеинизиращ реагент към 20 µl кръв, разбъркайте и центрофугирайте. Освен това определянето на глюкозата се извършва подобно на описаното в пример 2. В този случай или се препоръчва за домашна клинична практика (виж пример 1), или набор от готови аналитични форми от Lachema или Labsystems се използва като ензимна система. (Комплект Lachema: глюкозооксидаза - 4 u/ml, пероксидаза - 1 u/ml, 4-аминоантипирин - 0,8 mM, 4-хлоро-3-крезол-0,6 mM, буфер pH 8,4; комплект Labsystems: глюкозооксидаза - 20 u/ml, пероксидаза - 10 u/ml, 4-аминоантипирин - 0. 6 mm, р-хидроксибензенсулфонат - 20 mm, фосфатен буфер pH 7.0). Резултатите са представени в табл.4.
Както може да се види от таблица 4, литиевият перхлорат ви позволява да получите правилните резултати чрез определянеглюкоза чрез различни ензимни методи.
PRI me R 5. Изборът на оптималния диапазон от концентрации на литиев перхлорат.
Определянето на глюкозата се извършва в една част от цяла венозна кръв по същия начин, както е описано в пример 4, като се използва домашен комплект ензимни реактиви (вижте пример 1) и се променя концентрацията на литиев перхлорат от 0,05 М на 1,0 М. Резултатите са представени в таблица 5.
Както може да се види от таблица 5, оптималният диапазон на концентрациите на литиев перхлорат е 0,1-0,4 М. При стойности под 0,1 М определените концентрации са значително по-ниски (p