Откриване на вирусни патогени на гастроентерит при телета чрез PCR

ОТКРИВАНЕ НА ВИРУСНИ ПРИЧИНИ НА ГАСТРОЕНТЕРИТ ПРИ ТЕЛЕТА ЧРЕЗ PCR МЕТОД

П. К. АЯНОТ, А. М. ТИМИНА, С. А. ЧУПИН, В. А. КУДРЯВЦЕВ, М. И. ШУЛПИН, В. Ф. КОВАЛИШИН

Острите храносмилателни разстройства при телета от всички възрасти са един от проблемите на съвременното животновъдство. В много ферми се записва напускането на млади животни от първите дни от живота поради заболявания на стомашно-чревния тракт, които се появяват с диаричен синдром. За възникването им допринасят следните фактори: генетични, физиологични, санитарно-хигиенни и инфекциозни. Последните от своя страна са изключително разнообразни и включват голям набор от вирусни, бактериални, паразитни патогени и гъбички, които най-често се проявяват като смесени инфекции.

Поради сходството на клиничните, патологичните, анатомичните и епизоотологичните данни е невъзможно да се установи конкретна причина за заболяването без лабораторни изследвания. По правило вирусите са задействащият механизъм в патогенезата на инфекцията, след което в патологичния процес влизат бактерии, протозои и гъбички. В резултат на това животното умира не от вируси, а от микроорганизми, усложняващи хода на заболяването, които често са условно патогенни (Е. coli, ентеробактерии, актиномицети). Поражението на ентероцитите води до появата на обилна диария, загуба на апетит, което увеличава токсикозата, причинява дехидратация, сгъстяване на кръвта и нарушения на кръвообращението. Тогава настъпва дисбактериоза, а смъртта в повечето случаи се дължи на бактериални токсини и септицемия.

Навременното откриване на патогени с вирусна етиология ви позволява да определите причината за първичната диария, да изберете стратегия за превенция и лечение във всеки конкретен случай.случай и по този начин ограничава загубата на млади животни, свързана със симптомния комплекс на диария.

Напоследък широко разпространение получиха молекулярно-биологичните методи за откриване и характеризиране на патогени (полимеразна верижна реакция и секвениране), които се прилагат и в нашата лаборатория. Предимството на полимеразната верижна реакция (PCR) е нейната по-висока чувствителност и специфичност в сравнение с други методи. Използвайки PCR, можете да откриете вируса дори в минимални концентрации, които не могат да бъдат открити с други методи. PCR позволява в продължение на няколко цикъла да се размножи оригиналният геномен материал (ДНК или РНК на вируса, намиращ се в патологичния материал) до концентрация, която ще бъде записана с по-малко чувствителни методи (електрофореза). Използвайки PCR, почти всеки патоген може да бъде открит, с изключение на прионни инфекции, като спонгиформна енцефалопатия по говедата.

Методите за секвениране позволяват да се определи първичната структура на амплифицираните области на генома, а сравнителният им анализ позволява диференциране на щамове, в някои случаи серотипиране, установяване на филогенетични връзки, произход на изолата и източник на инфекция.

В момента служителите на нашата лаборатория са разработили и използват няколко тест системи за откриване чрез PCR на говежди ротавирус (RV), коронавирус (KB говеда), парвовирус (PV говеда) и вирус на говежда диария (VD), които са основните патогени на телета със симптоматична диария. Ентеро-, адено-, калици-, торо-, рео-, астро- и херпес вируси на говеда също участват в патологията на стомашно-чревни инфекции на млади животни, но те са много по-рядко срещани.

За 1999-2001гизследва проби от патологичен материал от говеда от 50 ферми (главно от регионите на Централния федерален окръг), за да определи причините за гастроентерит при телета, причинявайки значителни икономически щети. Честотата на животните в някои случаи (по време на масовото отелване) достига 90-100%, а броят на мъртвите и принудително умъртвени - понякога 70-85%. Тежестта на увреждането на храносмилателната система варира от леко катарално възпаление с краткотрайна диария до дълбоки патологии на повечето органи с наличие на хеморагичен, фибринозен, улцерозно-некротичен абомазоентерит с елементи на интоксикация и сепсис (хеморагии, дегенерация на паренхимни органи, хиперплазия на мезентериални лимфни възли, лимфоиден апарат на червата, далака), което води до смърт на телета. В тези ферми при младите животни често се наблюдават заболявания на дихателните органи, увреждане на лигавиците и др.

Целта на нашата работа е да покажем възможността за използване на молекулярно-биологични методи за идентифициране и характеризиране на патогени на гастроентерит при телета (рота-, корона-, парвовирус и вирус на диария) и да определим честотата на тяхното изолиране при говеда.

Материали и методи.За откриване на генома на патогени на чревни инфекции чрез PCR са изследвани проби от вътрешни органи, лигавици и чревно съдържание на телета, както и изпражнения и изтичане през носа. PCR и нуклеотидното секвениране се извършват по конвенционални методи

Резултати от изследването и дискусия. Тези вируси са локализирани главно в червата. Ентероцитите са мишени за репликацията на патогени от тази група. В процеса на размножаване вирусните частици разрушават клетките на чревната лигавица и навлизат в лумена, причинявайки високо натрупване вчревно съдържание и изпражнения.

Локализацията на всеки вирус в тялото има свои собствени характеристики. Например рота- и парвовирусите са открити само в стомашно-чревния тракт и изпражненията (Таблица 1). Коронавирусът е открит и в органите на дихателната система, тъй като засяга основно епителните клетки на дихателните и стомашно-чревните пътища. Вирусът на диарията обикновено се открива в чревната лигавица и нейното съдържание, но най-често в белите дробове и понякога в секретите от носа. При животните, патологията на стомашно-чревния тракт

Идентифициране на причинители на вирусни инфекции при говеда, протичащи с диариен синдром чрез PCR

Органи и тъкани на трупове

дневно заклани телета

Забележка: "++" - висока вероятност за

откриване на вируса в органите, "+

цервикалният тракт и респираторният тракт се наблюдават както заедно, така и поотделно. Очевидно при вирусна диария респираторната лигавица е вратата на инфекцията, така че вече на този етап се отбелязват клинични признаци на заболяването. В бъдеще патогенът се разпространява в цялото тяло и може да се намери в почти всички органи, но най-често в лигавичните клетки.

Най-често вирусът на диарията се изолира от патологичен материал в повече от 40% от случаите. Когато неговият геном беше показан чрез амплификация на 5' нетранслираната област, фланкираща единична отворена рамка, четене от 5' края на вирионната РНК, специфичен фрагмент беше открит при телета с диариен синдром в 21 от 49 изследвани ферми.

За вируса на диарията съществуването на серотипове не е доказано, но има диференциация на генотипове. В същото време представителите на различни генотипове ясно се различават един от друг. По този начин референтните и ваксиналните щамове, принадлежащи към първия генотип, иматоколо 30% разлики от представителите на втория генотип. Представители на различни генотипове също показват антигенни различия. Има случаи, когато серумът, получен срещу един генотип, не неутрализира инфекциозната активност на някои представители на друг генотип. Вирусът на диарията от втория генотип е предимно изолиран от серума на говежди ембриони, от постоянно заразени телета, родени от майки, ваксинирани с жива ваксина срещу вирусна диария, и животни, умрели по време на остра диария с хеморагичен синдром.

Всички идентифицирани от нас изолати принадлежат към първия генотип и имат 10–20% разлики от референтните щамове NADL, Oregon и Osloss и 30% от изолатите от втория генотип (Waters и 890). Никога не сме изолирали вируса на диарията от втория генотип, очевидно това се дължи на изключително рядката поява на този генотип в България.

Второто място по честота на откриване е заето от говежди ротавирус, който се характеризира с изключително разнообразна антигенна структура. Една от най-важните му антигенни характеристики е серотипът G, който се определя от свойствата на протеина VP7, който предизвиква образуването на вирус неутрализиращи антитела [10]. Чрез PCR и секвениране на VP7 генни фрагменти от български полеви изолати е установена относителната честота на срещане на различни G-серотипове на RV при говеда. Серотип G6 е регистриран в 58,3% от случаите, G8 - в 16,7%, G10 - в 20,8%, nG11 - в 4,2%.

Доста често телетата са били заразени едновременно с 2 или повече говежди RV изолата [7, 13]. Разработената техника, базирана на PCR, позволява едновременно откриване на 2 или 3 говежди RV изолата в една проба от патологичен материал и диференциране на техните G-серотипове. За тази цел в PCR се използва група от специфични за серотипа праймери. На изображениетоМоже да се види, че реакцията на амплификация включва 2 праймера (GC1 и GC3), универсални за ротавирусни серотипове G6, G8 и G10 (най-често срещаните G-серотипове на RV говеда), а реакцията на реамплификация включва един универсален праймер (GC2) и 3 специфични за серотипа праймера, сдвоени с GC2. Всеки от тези серотип-специфични праймери се свързва с VP7 генната област само на един от трите ротавирусни серотипа, G6, G8 или G10. Тези праймери са разположени на различни разстояния от сдвоения GC2 праймер; следователно, когато се тества проба, съдържаща 2 или 3 PB изолата, принадлежащи към различни G-серотипове, 2 или 3 фрагмента със съответния размер ще бъдат записани в реакционните продукти. С помощта на разработения метод при изследване на една проба са открити едновременно 2 RV изолата със серотипове G8 и G10. Използвайки анализа на нуклеотидната последователност на геномните региони, е възможно да се диференцират щамовете на ротавирусите.

При използване на PCR схемата с праймери, универсални за ротавируси от всички известни G-серотипове, беше идентифициран полеви говежди RV изолат, който вероятно е бил причислен към нов, неописан преди това G-серотип, тъй като се различава от всички предишни изследвани щамове с повече от 34% по отношение на нивото на нуклеотидна хомология на VP7 генния фрагмент. Това показва, че антигенното и генетично разнообразие на говежди RV не е напълно проучено и представлява интерес за по-нататъшни изследвания.

Анализът на нуклеотидните последователности на вариабилните области на HE и S гените на изследваните изолати потвърждава високата консервативност на вирусния геном. Първичната структура на изолатите, изолирани по различно време в България, Америка и Европа, се различава леко. Характерна особеност на HE генния фрагмент (919-1147) е, че заместванията се появяват предимно в определени позиции и в тяхПо принцип се наблюдават само 2 варианта на нуклеотиди. Това определя високата вероятност за тяхното случайно съвпадение, което може да определи сходството на нуклеотидните последователности на филогенетично отдалечени и значителна разлика между филогенетично близки щамове и изолати на вируса. Отбелязаните характеристики не ни позволяват да преценим филогенетичното сходство на изследваните щамове въз основа на сравнителен анализ на избрания HE генен фрагмент. Данните, с които разполагаме днес, не са достатъчни, за да се установи корелация между степента на филогенетична връзка между различните щамове KB на говеда и нивото на сходство на първичната структура на техния геном. Променливостта на изследваните геномни фрагменти обаче е достатъчна за диференциране на щамове, което е от голямо практическо значение, например при диференциране на полеви изолати от ваксинални вирусни щамове.

Парвовирусната инфекция на говедата, според нашите данни, е доста рядка. Специфичен фрагмент от говеждия PV геном е открит в материални проби от 1,5–7-месечни телета от 6 ферми. Най-често това са комбинации от стомашно-чревни и респираторни патологии.

Според резултатите от нуклеотидното секвениране и сравнителния анализ на VP2 генния фрагмент,

Идентифициране на вируси, които причиняват стомашно-чревна патология при говеда