ПРЕДИЗВИКАНОТО ОТ КАЛЦИЙ ОСВОБОЖДАВАНЕ НА СЪХРАНЕНИЯ КАЛЦИЙ ОПРЕДЕЛЯ ЗАПУСКВАЩИЯ ХАРАКТЕР НА ОТГОВОРИТЕ

предизвиканото

Цена:

Автори на произведението:

Научно списание:

Година на издаване:

ИНДУЦИРАНОТО ОТ КАЛЦИЙ ОСВОБОЖДАВАНЕ НА ДЕПОЗИРАН КАЛЦИЙ ОПРЕДЕЛЯ ХАРАКТЕРА НА ЗАПУСКАНЕТО НА ОТГОВОРИТЕ НА МЕЗЕНХИМНИТЕ СТРОМАЛНИ КЛЕТКИ КЪМ НОРАДРЕНАЛИН

ИНДУЦИРАНОТО ОТ КАЛЦИЙ ОСВОБОЖДАВАНЕ НА СЪХРАНЕНИЯ КАЛЦИЙ ОПРЕДЕЛЯ ЗАПУСКВАЩИЯ ХАРАКТЕР НА ОТГОВОРИТЕ НА МЕЗЕНХИМНИТЕ СТРОМАЛНИ КЛЕТКИ КЪМ НОРАДРЕНАЛИН

Способността на различни хептаспирални рецепторни агонисти (O-prolet-coupleph) да стимулират Ca2+ сигнализиране в мезенхимни стромални клетки (MSCs) на човешка мастна тъкан в култура беше анализирана с помощта на флуоресцентна микроскопия и Ca2+ индикатор Sio-4. По-специално беше идентифицирано

5% субпопулация от клетки, специфично реагиращи на норепинефрин чрез мобилизиране на вътреклетъчния Ca2+. Характерна особеност на тези клетки е, че отговорите към норепинефрин се генерират съгласно принципа „всичко или нищо“: агонистът или не стимулира откриваемата мобилизация на цитозолния Ca2+ при концентрация под прага (100–200 nM) или предизвиква Ca2+ отговори с почти максимална амплитуда. Използвайки фотолиза на фоточувствителния Ca2+ хелатор MR-BOTL, бяха създадени локални и глобални промени в свободния Ca2+ в цитоплазмата на MSCs. Пълното рязко повишаване на концентрацията на Ca2+ над праговото ниво предизвиква реакции, подобни на норепинефрин. При локално освобождаване на Ca2+, скоростта на разпространение на Ca2+ сигнала в цитоплазмата на MSC е с два порядъка по-висока от скоростта на пасивно разпространение поради дифузия в присъствието на Ca2+ буфер. Тези факти показват, че MSC имат функциониращ механизъм, който осигурява Ca2+-индуцирано освобождаване на отложен Ca2+. Инхибиторният анализ показа, че на дветевъзможни мишени на вътреклетъчния Ca2+, които осигуряват стартирането на регенеративния процес - рианодиновия рецептор и 1P3 рецептора - последният действа като тригер. Получените данни предполагат, че задействащият характер на отговорите на MSC към норепинефрин се определя от факта, че при достигане на праговото ниво, първоначалното зависимо от агониста повишаване на вътреклетъчния Ca2+ стимулира 1P3 рецепторите и предизвиква лавинообразно освобождаване на Ca2+ от депото.

Ключови думи: мезенхимни стромални клетки, адренорецептори, Са2+ сигнализация, рианодин и 1Р3 рецептори.

Повечето от трудовете с мезенхимни стволови клетки са посветени на анализа на техния трансплантационен потенциал, изследването на тяхната диференциация и възможността за контрол на този процес in vitro [1, 2]. Много по-малко внимание се обръща на фундаменталните изследвания на физиологичните процеси в тези клетки, поради което съществуващите представи за техните рецепторни и сигнални системи са много ограничени. Въпреки че вътреклетъчните калциеви йони са универсален регулатор на процесите на пролиферация и диференциация и един от основните медиатори, участващи във вътреклетъчното сигнализиране, проучванията в

тази област са представени с единични произведения. Те се отнасят главно до изследването на спонтанни калциеви осцилации и участието на външен калций в развитието на мезенхимни стволови клетки [3]. Междувременно изследването на индуцираното Ca2+ сигнализиране изглежда по-уместно; сигнализация, стимулирана от външни влияния, включително агонисти на различни рецептори. Сред тях може да има агенти, които предизвикват диференциацията на тези клетки, което е от несъмнен практически интерес.

Много трудна, ако изобщо е разрешима, е задачата на физиологиятаизследвания

индивидуални мезенхимни стволови клетки in situ. Затова стволовите клетки обикновено се анализират, изолират по определен метод от различни тъкани и се поддържат в първична култура, за което се използва специален термин – мезенхимни стромални клетки (МСК) [4]. Една от текущите задачи на нашето изследване е анализът на физиологичните процеси в МСК, получени от човешка мастна тъкан. Оценявайки тяхната способност да реагират на различни хептаспирални (G-протеин-свързани) рецепторни агонисти, ние открихме, по-специално, че норепинефринът стимулира Ca2+ сигнализирането в тези клетки. В тази работа ние демонстрираме задействащия характер на Ca2+ отговорите на MSCs към норепинефрин и показваме, че това характерно свойство се определя от механизма на Ca2+-индуцирано освобождаване на отложен Ca2+.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Изолиране на МСК от мастната тъкан и тяхното култивиране. Човешки MSC бяха изолирани от подкожната мастна тъкан на здрави донори (възраст от 31 до 50 години, n = 18). Мастната тъкан се натрошава и се смесва с ензимни разтвори на колагеназа тип I (200 U/mL) (Worthington, САЩ) и диспаза (40 U/mL) (Sigma, САЩ) при съотношение на обема на тъканта към обема на ензимния разтвор 1: 2. Суспензията се инкубира при 37°C за 30–60 минути, като периодично се разклаща. След това равен обем от базална среда за недиференцирани човешки мезенхимни стволови клетки (HyClone, САЩ), съдържаща 10% Advance Stem Supplement (HyClone), се добавя към получената суспензия за инактивиране на ензимите и се центрофугира при 200 g за 10 минути. Супернатантът и адипоцитната фракция бяха отстранени. Утайката се ресуспендира и еритроцитите се лизират. Получената суспензия се филтрира през найлонови филтри с размер на порите 100 μm (BD Bioscience, САЩ). Клетките бяха ресуспендирани врастежна среда (виж по-долу), засадена в петриеви панички в количество от 100 хиляди клетки/ml и инкубирана при 37°C, 5% CO2. На следващия ден средата се смени в съдовете, за да се отстранят неприкрепените клетки.

Изолираните MSCs се култивират върху пластмасови петриеви панички (Corning, САЩ) и/или в 12-ямкова плака в Advance Stem (HyClone) с 10% Advance Stem Supplement (HyClone), 100 U/mL пеницилин и 100 U/mL стрептомицин. При достигане на 80% от монослоя, клетките се пасират. Клетките се третират с разтвор на Versene (Sigma) и HyQTase Cell Detachment Solution (HyClone) и след това се посяват в съотношението

съотношение 1 : 4. В експериментите са използвани пасажи MCK 2–4.

Подготовка на клетките за експеримента. Преди експеримента клетките се култивират в средата (виж по-горе) без антибиотици в продължение на 12 ч. След това клетките се промиват два пъти с разтвор на Versen (Sigma). За да се отделят от субстрата, клетките се инкубират за 3–5 минути в 2CC µl от ензима HyQTase (HyClone). Ензимът се инхибира чрез добавяне на BCC µl от пълна растежна среда, клетките се ресуспендират и се поставят в Eppendorf. Клетките се пелетират чрез центрофугиране при 0.8 g за 45 s.

Elets бяха прикрепени с помощта на Cell Tak към дъното на фотометричната камера, която представлява покривно стъкло Menzel-Glaser с пластмасови страни, и след това заредени с Fluo-4 флуоресцентна Ca2+ сонда. За това клетките се инкубират при стайна температура (23–25 ° C) в присъствието на проникващ аналог на Fluo-4AM (4 μM) в присъствието на Pluronic детергент (0, 02%) (и двете Molecular Probes, Съединени щати) в продължение на 20 минути, по време на които хидролизата на Fluo-4AM ацетоксиметиловата група от вътреклетъчни естерази произвежда достатъчно количество Fluo-4. След това клетките се промиват с извънклетъчен разтвор (NaCl - 110 mM, KCl - 5,5 mM, CaCl2 - 2 mM, MgSO4 - 0,8 mM, NaH2PO4 - 1mM, HEPES -10 mM, глюкоза - 10 mM), в която те се държат при 4°С в продължение на 40 минути. Когато е необходимо, 2 mM CaCl2 в извънклетъчния разтвор се заменя с 0,5 mM EGTA + 0,4 mM CaCl2, при което концентрацията на свободния Ca2+ е 260 nM.

Микрофотометрия. Повечето от описаните експерименти бяха проведени с помощта на обърнат флуоресцентен микроскоп Axiovert 135 (Zeiss, Германия), оборудван с обектив Plan NeoFluar 20x/0.75 и цифрова ECCD камера LucaR (Andor Technology, САЩ). В допълнение към осветителя за преминаваща светлина, микроскопът е оборудван с осветител за оптични влакна за осветяване през обектива. Един от входовете на бифуркационното оптично влакно беше свързан към осветител, използващ свръхярки диоди (340–535 nm) [5] за възбуждане на флуоресценция, а другият вход беше свързан към лазер LCS-DTL-374QT (Lazer-Export, България), който беше използван за стимулиране на фотолиза при дължина на вълната 355 nm. Флуоресценцията на клетки, натоварени с Fluo-4, се възбужда при дължина на вълната от 480 ± 5 nm и излъчването се записва в областта от 535 ± 20 nm. Последователни флуоресцентни изображения се записват всяка секунда. Промяната в концентрацията на цитозолния калций в отделните клетки се оценява от относителната промяна в интензитета на флуоресценция на цялата

клетки (AF/F0). Количественият фотометричен анализ на изображенията беше извършен с помощта на програмата Imaging Workbench 6 (INDEC, САЩ).

Фоточувствителен Ca2+ хелатор NP-EGTA беше използван за поетапна промяна на вътреклетъчния Ca2+. Фотолизата на това вещество чрез светкавица в ултравиолетовия диапазон (355 nm) инициира импулсно освобождаване на Ca2+ в клетъчната цитоплазма. В съответните експерименти клетките бяха заредени едновременно с Fluo-4 и NP-EGTA.

конфокална микроскопия. В числоПо време на експериментите разпределението на Ca2+ сигнала в клетките беше анализирано с помощта на конфокален сканиращ микроскоп Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Германия) и маслен имерсионен обектив Leica HCX PL APO CS 63.0 x 1.40. Клетките бяха засадени един ден преди експеримента върху 8-ямкови плаки, чието дъно беше оформено от покривно стъкло (Nunc Lab-Tek 8 well chambered coverglass, Thermo Scientific, САЩ). Преди експеримента инкубационната среда беше заменена с разтвор, състоящ се от 9 части MEM среда (HyClone, САЩ), съдържащ 20 mM HEPES (HyClone, САЩ) и една част от реагента Pluronic (Abcam Fluo-8 No Wash Calcium Assay Kit, Abcam, Англия), в който Fluo-8 AM (Abcam Fluo-8 No Wash Calcium Assay Kit, Abcam, Англия) и NP-EGTA AM (Invi trogen, САЩ). Fluo-8 AM (3 μM) и NP-EGTA AM (3 m^) бяха добавени към всяка ямка и клетките бяха инкубирани за 1 час при 37°C. След това клетките се промиват в MEM, съдържащ HEPES (20 тМ). стрелба пр

За по-нататъшно четене на статията трябва да закупите пълния текст. Артикулите се изпращат във форматPDFна пощата, посочена при плащането. Времето за доставка епо-малко от 10 минути. Цената на една статия е150 рубли.

Подобни научни трудове на тема "Биология"

С. С. Колесников, П. Д. Котова, О. А. Рогачевская, В. Ю. Сисоева, В. А. Ткачук, Ю. И. Фадеева — 2015 г

С. С. Колесников, О. А. Рогачевская, В. Ю. Сисоева и М. В. Тарасов — 2015 г

С. С. Колесников, П. Д. Котова, О. А. Рогачевская, В. Ю. Сисоева и М. В. Тарасов — 2014 г

А. В. Бережнов, Л. П. Долгачева, В. В. Динник, В. П. Зинченко, Н. П. Каймачников, Е. И. Маевский, А. В. Толмачева, М. В. Туровская и Е. А. Туровски — 2011 г