Резюме Вероятни функции на протеини, синтезирани по време на хипотермия - Банка с резюмета, есета,
Има сравнително малко данни за природата и функцията на протеини, чийто синтез се стимулира от хипотермия. В повечето изследвания е показана само връзката на процеса на студено втвърдяване с протеиновия синтез. В същото време тази корелация предполага важна роля на протеините при формирането на втвърденото състояние на растението. Предполага се, че един от незаменимите фактори, необходими за индуцирането на устойчивост на замръзване при зимната ръж, е повишеното образуване на протоплазма и клетъчни мембрани.
Редица изследвания показват влиянието на гени, локализирани в определени хромозоми на ядрото, върху активността на митохондриите по време на хипотермия. Установено е, че охлаждането на устойчиви на замръзване растения от зимни житни култури води до значителни промени в интензивността на работата на дихателната верига на митохондриите и в степента на конюгиране на процесите на окисление и фосфорилиране. Впоследствие беше показан ядрен контрол върху проявата на тази черта, тъй като въвеждането на хромозоми от X-генома на високо устойчива на замръзване житна трева в генотипа на зимна пшеница с ниска студоустойчивост беше придружено от митохондриална реакция на охлаждане, което е типично за форми с висока устойчивост на замръзване, т.е. бърз преход на митохондриите към нискоенергийно състояние. Замяната на хромозомите на X генома на житната трева с хромозомите на D генома на житната трева в клетките на хибрида на житната трева забави тази реакция на митохондриите към охлаждане. Проучванията, проведени върху митохондриите на 43 хромозомни линии, показват, че гените, контролиращи тази митохондриална черта, вероятно са разположени на две хромозоми на X генома. Изследване на линии с междусортово заместване на хромозоми, при което всички двойки хромозоми на D-генома, както и някои хромозоми на А- и В-геномите на зимна пшеница Безостая 1 са заменени със съответните двойки хромозомина високо устойчив на замръзване сорт пшеница Albidum 114 показа, че само две хромозоми от генома на пшеницата Albidum 114 контролират енергийната активност на митохондриите по време на хипотермия. По този начин, тъй като, както е показано по-горе, блокирането на синтеза на цитоплазмен протеин предотвратява преминаването на митохондриите в ниско енергийно състояние по време на хипотермия, може да се предположи, че ядрото участва в регулирането на митохондриалната активност по време на хипотермия чрез промени в протеиновия синтез.
Дехидрини иABA- регулирани протеини
Напоследък изследователите са много заинтересовани от изучаването на промените в синтеза на дехидрини под влияние на студената аклиматизация. Промени в транскрипцията на гените за протеините LEA, RAB и DHN първоначално са отбелязани под действието на воден стрес и след третиране на растенията с абсцицинова киселина. Всички тези групи протеини се характеризират с висока хидрофилност на протеиновата молекула. По време на клетъчна дехидратация при воден стрес, тези протеини, поради високата си хидрофилност, предотвратяват загубата на вода от клетката и стабилизират клетъчните протеини. Впоследствие беше установено, че синтезът на тези протеини се засилва и по време на студена аклиматизация. В същото време дехидрините очевидно предотвратяват образуването на лед в клетките и също така стабилизират клетъчните протеини.
Сред протеините, натрупващи се в растенията в отговор на дехидратация или ниски температури, дехидрините от семейството LEA D II са най-интензивно изследвани. Дехидрините се състоят от различни домени, типични за протеини от този тип, които са комбинирани в няколко от най-често срещаните полипептидни варианти, както и множество редки вариации. Тези домейни включват една или повече малки амфипатични области на алфа спирала.остатъци, серинови остатъци и N-терминална последователност. Досега всички биохимични функции на дехидрините са неизвестни, но значителен брой изследвания, посветени на изясняването на локализацията на дехидрините в клетката чрез клетъчно фракциониране и имунолокализация, установиха, че дехидрините могат да бъдат локализирани както в ядрото, така и в цитоплазмата. Освен това получените данни показват, че този клас протеини е свързан с макромолекулите на нуклеопротеиновия комплекс в ядрото и с цитоплазмените мембрани. Понастоящем се смята, че дехидрините са фактори, които предотвратяват коагулацията на редица макромолекули, като същевременно запазват структурното си единство по време на излагане на стрес.
Подобрено възстановяване на замразени меристеми и калуси от касис се получава след 2 часа предварителна обработка със захароза, пролин, RAB протеини или говежди серумен албумин. Двучасово потапяне в 0,4 M RIB-SM преди замразяване значително подобри повторното израстване на меристема в сравнение с 0, 1, 3 и 4-часово потапяне. Два часа потапяне на меристема в 5% и 10% пролин, разтворен в 0,4 M RIB-SM, значително подобрява повторното израстване след замразяване. Първичен тест със сурови RAB P екстракти от пшенични семена показа, че повторният растеж на замразени апикални меристеми на касис се подобрява след 2 часа предварителна обработка чрез потапяне с максимум на оцеляване от 1% RAB P. RAB P препаратите, съдържащи еквивалентни протеини, имат подобен ефект върху повторния растеж, което показва, че ефектът зависи от наличието на протеини, а не от захари и други въглехидрати в суровите екстракти от RAB P Подобни резултати показват меристеми и калуси, предварително третирани с 5 или 10% пролин, 1% разтвор на RAB P или 1% BSA в 0,4 М разтвор на захароза. Предварително обработени меристемипродължава да расте 3 дни след затопляне и достига максимален повторен растеж на 1 седмица, в сравнение с 2 седмици за предварително третираната контрола.
При изследването на ефекта на късия ден върху Betula pubescens беше установено, че в допълнение към различни конститутивни синтезирани дехидрини, два специфични полипептида с молекулни маси 34 и 36 kDa бяха открити на късия ден.
Четири клона на дехидрини бяха характеризирани от cDNA библиотека, получена от корените на разсад от Triticum durum разсад, подложен на воден стрес. Два от тях, ptd27e и ptd16, кодират протеини с класически дехидринови характеристики, т.е. консенсусен мотив KIKEKLPG, който присъства извън последователността от серинови остатъци в карбоксилния край. Протеините, кодирани от Tddhn15 и Tddhn16, са подобни на последователностите на протеините на Triticum aestivum. Клонове ptd25a и ptd38 кодират дехидрини, които нямат последователност от серинови остатъци и имат сходство на последователността с Cor протеините на T. aestivum. За да се свърже устойчивостта на T. durum към суша с експресията на гена на дехидрин, натрупването на транскрипт на дехидрин в корени и издънки на разсад в отговор на воден стрес и екзогенна абсцизова киселина беше сравнено за четири сорта. Проучване на ефекта от водния стрес с течение на времето показа, че натрупването на транскрипти на дехидрин се забавя при сортовете, устойчиви на суша. В същото време нивото на натрупаните транскрипти е по-високо при устойчивите на суша сортове, отколкото при чувствителните към суша сортове. Подобни резултати бяха отбелязани след екзогенно третиране с абсцицинова киселина.
Ролята на хормон като абсцизовата киселина в устойчивостта на растенията към ниски температури е изследвана в Arabidopsis с помощта намутанти, при които биосинтезата или начинът на действие на този хормон е променен. Различни мутанти бяха използвани за анализиране на ролята на ABA в развитието и покълването на семената и устойчивостта на стрес. Мутантите са изолирани главно според променените характеристики на покълването и растежа на разсада. Генът на зеаксантин епоксидаза, кодиран от гена aba1, беше клониран чрез хомология с гена на Nicotiana plumbaginifolia, блокиран на същата биосинтетична стъпка. В същото време беше разкрито биохимично увреждане на мутантите aba1, aba2 и aba3. Нечувствителните към ABA мутанти също имат фенотип, който се влияе от различни зависими от ABA процеси и по този начин предполага, че те или кодират ранни стъпки в сигнализирането на ABA, или засягат специфични стъпки. Гените abi1 и abi2 кодират ензима протеин фосфатаза 2с, а генът abi3 кодира транскрипционен фактор със специфична експресия в семена. Свръхчувствителният към абсцицинова киселина era1 мутант има аномалия във фарнезил трансферазата.
Възстановяването на in vitro криоконсервираните краища на издънки на бреза се подобрява двойно чрез включването на абсцицинова киселина в хранителната среда по време на студено втвърдяване на майчините издънки. Нивото на възстановяване на края на издънките след студено втвърдяване в продължение на 28 дни при +5 0C в 8/16 часа фотопериод върху среда, съдържаща 10 -4 М абсцицинова киселина, е повече от 40%. Абсцизовата киселина е ефективна само в комбинация с ниска температура и къса продължителност на деня, въпреки че по време на експериментите са отбелязани големи генотипни разлики. Абсцизовата киселина има два различни ефекта: повишено студено втвърдяване и повишено образуване на калус по време на регенерацията на криоконсервирани краища на издънки.
Предотвратяване на протеиниобразуване на лед
Една от функциите на протеините, синтезирани в растенията по време на хипотермия, по-специално под действието на отрицателни температури, е да предотвратяват процеса на образуване на лед. Въпреки че, както беше отбелязано по-горе, основното понижение на температурата на началото на образуването на лед възниква поради натрупването на захари в растителната клетка в резултат на повишен синтез и повишаване на активността на съответните ензими, в растителните клетки по време на хипотермия се извършва и синтезът на специфични протеини, които пряко влияят върху температурата на началото на образуването на лед и растежа на ледените кристали.
Способността да се контролира образуването на извънклетъчен лед по време на замразяване е от решаващо значение за оцеляването на растенията, устойчиви на замръзване. Протеините против замръзване, които са протеини, способни да инхибират растежа на ледени кристали, наскоро бяха идентифицирани като най-разпространените апопластични протеини в листата на студено аклиматизираната зимна ръж. Сравнения на амино-терминални последователности, имуно-кръстосана реактивност и ензимна активност показват, че тези антифризни протеини са подобни на членове на три класа протеини, свързани с патогенезата, а именно ендохитинази, ендо-бета-1,3-глюканази и подобни на тауматин протеини. Апопластичните ендохитинази и ендо-бета-1,3-глюканази са силно индуцирани от патогени в чувствителен към замръзване тютюн и нямат антифризна активност. Констатациите предполагат, че свързаните с патогенезата протеини може да са развили фини структурни разлики, които позволяват на тези протеини да могат да се свързват с лед.
Антифризните протеини имат способността да инхибират образуването на лед. За да се обясни тяхната роля в този процес, тяхната концентрация иимунолокализация на тези протеини в листа, издънки и корени на зимна ръж. Всеки от общите разтворими протеини, извлечени от студено аклиматизирани ръжени листа, стъбло и корен, има антифризна активност, докато не се наблюдава антифризна активност в екстракти от неаклиматизирани ръжени растения. Антитела, получени срещу три апопластични антифризни протеини от ръж, съответстващи на подобен на глюконаза протеин, подобен на хитиназа протеин и подобен на тауматин протеин, бяха използвани за обработка на тъканни отпечатъци. Доказано е, че антифризните протеини са локализирани в епидермиса и в клетките около междуклетъчните пространства в растенията, аклиматизирани към студа. Въпреки че GLP, CLP и TLP присъстваха в неаклиматизирани растения, те бяха открити другаде и нямаха антифризна активност, което предполага, че други изоформи на патогенно-свързани протеини се произвеждат при ниски температури. Локализацията на антифризните протеини в ръжта може да предотврати вторично клетъчно увреждане от епифитен лед или лед, разпространяващ се през ксилемата. Разпределението на свързаните с патогенезата протеини и акумулиращите студ GLP, CLP и TLP протеини е подобно и може да отразява общите пътища, по които както патогените, така и ледът навлизат и се разпространяват през растителните тъкани.
Синтетично генът на протеина против замръзване се експресира в растения и, както показват резултатите от експериментите, намалява изтичането на електролит от листата при температури на замръзване на почвата. Синтетично протеинът против замръзване се експресира като сливане със сигнален пептид, насочващ го към междуклетъчното пространство, където за първи път се появява ледена кристализация. Генът е въведен в Solanum tuberosum L. Cv. Russet Burbank с Agrobacterium-опосредствана трансформация. Трансформантите се идентифицират чрез PCR скрининг и експресията на въведения протеин се проверява чрез имуноблотинг. Анализът на освобождаването на електролити от листата на трансгенни растения разкри връзка между нивото на експресия на трансгенния протеин и степента на толерантност към замръзване на почвата.
Използването на методи, базирани на изследване на рекристализацията на лед, наскоро позволи да се установи наличието на протеини с антифризна активност в редица растителни видове. По-специално, нов студено-индуциран антифриз протеин с молекулно тегло от 36 kDa беше изолиран и идентифициран в корена на студено аклиматизирани моркови. В хода на изследване на неговите свойства беше установено, че този протеин инхибира прекристализацията на лед и има термохистерезисна активност.
Доказано е, че този полипептид съществува в разтвор като N-гликозилиран мономер. Протеинът, подобно на други известни антифризни протеини, е локализиран в апопласта. Генът, съответстващ на този протеин, както показват резултатите от изследванията, е уникален и се индуцира от студ.
Студено регулиран протеин
Много растения, включително Arabidopsis, повишават устойчивостта на замръзване след излагане на ниски температури без замръзване. Този отговор, наречен студена аклиматизация, се медиира от ДНК регулаторния елемент C-repeat/sushing-responsive element и е свързан с индукцията на COR гени. Повишената експресия в Arabidopsis на CBF1, транскрипционен активатор, който се свързва с CRT/DRE последователността, индуцира експресията на COR гени и повишава устойчивостта на замръзване на неаклиматизирани растения Arabidopsis. Въз основа на тези данни се стигна до заключението, че CBF1 е вероятен регулатор на студааклиматизация, която контролира нивото на експресия на COR гените и допринася за повишаване на устойчивостта на замръзване.