ТИТРУВАНЕ НА ВИРУС В проби от алантоисна течност преди обединяване и инактивиране
0,5 ml, а в останалите 9 епруветки - 0,25 ml физиологичен разтвор. 0,05 ml алантоична течност се добавя към първата епруветка (т.е. първоначалното разреждане е 1:11 или 1,04 в логаритмични единици); след това, прехвърляйки 0,25 ml от ямка в ямка, се прави серия от двукратни разреждания в диапазона от
1:11 до 1:5632 (от 1,04 до 3,75 логаритмични единици). След това във всяка ямка се добавят 0,025 ml 5% суспензия от пилешки еритроцити във физиологичен разтвор. Панелите се разклащат и се поставят в хладилник при 4°C. Разклатете отново след 20 минути. Реакцията се взема предвид след 40 min инкубиране при 4°C.
При липса на аглутинация (-), утаените еритроцити образуват плътен бутон на дъното на дупката, докато при пълна аглутинация (+ +) те покриват цялото дъно с тънък розов слой. За крайна точка на титруването условно се приема такава степен на аглутинация (+), при която диаметърът на еритроцитната утайка е една трета от диаметъра на ямката. Чрез интерполиране до тази крайна точка отговорът може да бъде отчетен с точност от +0,033 логаритмични единици (±8%); ако последната епруветка с пълна аглутинация се приеме за крайна точка на титруването, тогава грешката на метода ще се увеличи до ±0,27 логаритмични единици (±86%).
Ако титруването се извършва върху микротитърни панели (в обем 0,025 ml; първо разреждане 1:2), концентрацията на еритроцитната суспензия се намалява до 1'% и сместа се инкубира два пъти за 20 минути при 4°C.
Една хемаглутинираща единица (HAU) е количеството вирус, което предизвиква аглутинация (+) в 1 ml 1% суспензия от пилешки еритроцити. Тази единица съответства на около 4-107 (7,6 логаритмични единици) вирусни частици (Pagecas de 51. Orosh, Siles, 1952).
Така например, ако по време на титруване от началнияреакцията на разреждане 1:11 (+) се записва в 6-та епруветка, тогава нашата система ще съдържа 11 * 32 (25 = 32) аглутиниращи дози. Тъй като реакцията протича в обем от 0,25 ml, трябва да умножим тази стойност по 4. Но тъй като крайната концентрация на червени кръвни клетки в системата е 0,5%, а не 1%, получената стойност трябва да бъде разделена на 2. В резултат на това получаваме титър от 704 HAU / ml, или 2,847 логаритмични единици. Същото се получава по по-прост начин чрез добавяне на логаритъма на първоначалното разреждане към логаритъма на крайната точка на титруването
1,04+1,8=2,84. (Разликата в третия знак след десетичната запетая е резултат от закръгляването на логаритмите както на първоначалното разреждане, 1,0414, до 1,04, така и на множителя от 0,30103 до 0,3 = 1o^2). Броенето с помощта на логаритми също е подходящо за фракционни титри. И така, при първоначално разреждане 1: 500 с пълна аглутинация във втората епруветка (++) и при отсъствието му в третата (-), крайната точка на титруването пада върху 2,5 епруветки; следователно логаритъма на титъра ще бъде 2,7 + (0,3-2,5) = 3,45, а самият титър ще бъде 2818 GAU / ml.
Средният добив на вирус Сендай в алантоична течност е около 1800 HAU/ml, или 3,25 + 0,20 логаритмични единици.