Уравновесяване на спермата със среда, съдържаща глицерол
Има противоречиви мнения по отношение на продължителността на времето, през което сперматозоидите трябва да бъдат в контакт с глицерол преди замразяване.
Методът на Polge с контакт за 18-24 часа дава добри резултати по отношение на подвижността на сперматозоидите след замразяване и размразяване и процента на забременелите крави в резултат на изкуствено осеменяване. Според O'Dell и Hurst, процентът на говежди сперматозоиди, които са преживели замразяване в разредител на глицериниран цитрат жълтък или в обезмаслено мляко, е по-висок в проби, замразени малко след добавянето на глицерол, в сравнение с тези, които са били уравновесени със среда за 18 часа. Emmens и сътрудници заявяват, че 30 минути са достатъчни за уравновесяване на спермата с глицеринов разредител. Разредителят, който използваха, освен глицерол и натриев цитрат, съдържаше арабинозни и фосфатни буфери. Тези компоненти могат да променят експерименталните условия до такава степен, че незабавното замразяване да стане възможно и дори желателно. По-късно обаче Еменс и Мартин установиха, че няма разлика в процента на бременни крави, когато са осеменени с проби от сперма, които са били уравновесени с глицерол за няколко часа преди замразяване, и сперма, замразена след краткотрайно уравновесяване. Съвсем наскоро Блекшоу и др., съобщиха, че балансирането в продължение на 18 часа повишава оцеляването на спермата в проби, замразени за продажба. Повечето изследователи са получили по-добри резултати чрез замразяване на спермата след еквилибриране с глицерол за 6-18 часа.
Polge показа, че реанимацията на третирани с глицерин говежди сперматозоиди след замразяване зависи от много фактори, които от своя страна са свързани сскорост на замразяване. Има критична температурна зона от -15 до -25°C, в рамките на която изглежда възниква повреда поради прекалено бързо или прекалено бавно охлаждане. Сперматозоидите, които са били 18 часа в среда, съдържаща яйчен жълтък, натриев цитрат и глицерол, са по-устойчиви на увреждане в критичната температурна зона. Сперматозоидите, които са били в среда, съдържаща глицерол за кратко време, могат да бъдат устойчиви на увреждане в тази температурна зона само ако се охладят много бързо. Следователно противоречията в литературата относно значението на уравновесяването с глицерол преди замразяване може да се дължат на използването на различни скорости на замразяване в рамките на посочената критична температурна зона. Polge отбелязва, че положителният ефект, който продължителното равновесие с околната среда има върху сперматозоидите, вероятно се дължи на действието на други компоненти, а не на глицерол. Например, защитният ефект на липидите и липопротеините срещу температурен шок ще се увеличи, ако сперматозоидите са в контакт с тези вещества за по-дълго време преди охлаждане. Сега е известно, че в сперматозоидите и липидният метаболизъм протича много интензивно.