Вмъкване на човешки ген в бактериална ДНК
- трудно се въвежда ДНК в клетката. Имаме нужда от вектор, който ще транспортира ДНК в клетката;
Веднъж попаднала в клетката, човешката ДНК ще бъде разпозната като чужда от бактерията въз основа на факта, че бактериалната ДНК е кръгла, а човешката е линейна. Бактерията ще унищожи чужда ДНК. Следователно е необходимо да се вмъкне човешка ДНК в кръгла форма.
Повечето бактерии имат една пръстенна хромозома. За щастие, те също имат малки допълнителни участъци от ДНК, наречени плазмиди. Както е показано на фиг. 7.2, плазмидите са малки кръгли структури, които съществуват независимо от основната хромозома на бактерия. Те обикновено съдържат по-малко от 5% информация и не съдържат жизненоважната информация, необходима на клетката, за да оцелее. Плазмидите съдържат няколко гена, отговорни за оцеляването при екстремни условия на околната среда. Всички те са много подходящи за вашата цел, тъй като плазмидите могат да служат като вектори.
Ориз. 7.2. Плазмиди
Плазмидът може да бъде нарязан с рестрикционни ензими, като по този начин се получава линейна ДНК. Заедно с откриването на обратната транскриптаза, откриването на рестрикционните ензими, които обикновено съществуват в бактериалната клетка, беше решаващо за развитието на генното инженерство. Първият рестрикционен ензим е изолиран от бактерии и характеризиран с G.O. Смит (H.O. Smith), К. Уилкокс (K. Wilcox) и Дж. Кели (J.J. Kelly) през 1968 г. Такива протеини, които обикновено присъстват в клетките, разрязват ДНК молекулите при определени последователности от азотни бази. Това е четвъртата стъпка в процеса, описан на фиг. 7.8.
Защо една бактериална клетка има ензими, които разрязват ДНК молекулата на парчета? Наличието на тези ензими е полезно забактерии, тъй като го предпазват от бактериофаги – вируси, които атакуват бактериите. Когато вирусна ДНК се въведе в бактерия, тя се атакува от рестрикционни ензими и се унищожава. Собствената бактериална ДНК е защитена от рестрикционните ензими чрез наличието на уникални метилови групи върху двойки азотни бази. Тези метилови групи предотвратяват взаимодействието с рестрикционните ензими, от които досега са идентифицирани повече от 900. Всеки ензим има свое специфично активно място. Известни са повече от 200 уникални ДНК последователности, които се разпознават от различни рестрикционни ензими. Рестрикционните ензими са специфични за последователности от десет бази в ДНК. На примера, показан на фиг. 7.3, рестрикционните ензими разрязват ДНК между G-C и T-A базовите двойки.
Ориз. 7.3. Рестриктази
Можете да отрежете плазмида, където пожелаете, като изберете рестрикционен ензим, който отрязва плазмидната ДНК в избраната базова последователност. Освен това знаете, че ако срежете ДНК с рестрикционни ензими, тогава така наречените "лепкави краища" ще останат по краищата. Това се случва, защото рестрикционният ензим оставя назъбен или назъбен ръб. Краищата не са буквално лепкави, но съдържат къси парчета едноверижна ДНК. Тези фрагменти лесно ще се съединят с нова ДНК, съдържаща комплементарни базови последователности. На фиг. 7.3 "лепкави краища" се състоят от G-A-T-T фрагменти в единия край и C-T-A-A в другия край. Тези краища ще се "залепят" съответно за C-T-A-A и G-A-T-T фрагментите. Между лепкавите краища могат да се добавят допълнителни базови двойки. Можете да изолирате плазмиди от бактерии и да използвате рестрикционни ензими, за да изрежете дупка в бактериалния плазмид и след това да поставите желания ген в него.
Също така е необходимо да се създадат "лепкави краища" на гена,използвайки подходящия рестрикционен ензим. Избирайки рестрикционен ензим, вие избирате нуклеотидите, които ще бъдат върху "лепкавите краища" на счупената ДНК. Но какво ще стане, ако генът, който търсите, няма съвместими "лепкави краища", за да се свърже с разбития плазмид? Биотехнологичната индустрия е предвидила вашето желание и е създала набор от малки участъци от ДНК, които съдържат всякакви последователности, подходящи за допълващо свързване към лепкави краища. Те могат да бъдат добавени към вашия ген с помощта на ензима ДНК лигаза. Това е третата стъпка, показана на фиг. 7.8. Сега можете да вмъкнете гена в плазмида и да създадете ръчно изработена рекомбинантна ДНК, както е показано на фигура 1. 7.4. Това е петата стъпка на фиг. 7.8. Спомнете си, че започнахте с иРНК на островчетата, защото те произвеждат много инсулин и се опитвате да получите инсулиновия ген.
Ориз. 7.4. Вмъкване на ДНК в бактериален плазмид или генериране на рекомбинантна ДНК
Голям процент (но не всички) от гените, създадени от предварително получена иРНК, всъщност ще бъдат гени, кодиращи инсулин. Някои от плазмидите ще вмъкнат инсулиновия ген. Островните клетки обаче синтезират и редица други протеини и някои от получените гени ще кодират тези протеини. На този етап няма да можете да изберете само гените, които кодират инсулина. Следователно след инкубация някои плазмиди ще съдържат други гени, а някои плазмиди изобщо няма да съдържат нов генетичен материал. И не можете да различите тези плазмиди. Сега вмъквате всички плазмиди, само част от които съдържат интересния ген, в бактериалната популация. На бактериите е дадена известна стимулация чрез третиране с разтвор на калциев хлорид, което ще позволи на плазмидите да влязат. Такъв процес се наричатрансформация. Това е стъпка 6 на фиг. 7.8.