Други методи за оценка на въздействието на радиацията върху организма - Микронуклеарен тест
Метафазният метод (Метафазен анализ) се използва за отчитане на хромозомните аберации в соматичните клетки на животни и хора, изисква много време и висока квалификация на изследователя. За първи път е използван в радиационната генетика. Отличен количествен и качествен анализ на хромозомни аномалии.
Този метод разкрива както нестабилни хромозомни аберации - дицентрики, пръстени, фрагменти, така и стабилни аберации (транслокации) [10]. Най-развитият и широко използван метод на биологична дозиметрия (набор от цитогенетични тестове) е анализът на честотата на нестабилни хромозомни аберации (дицентрични и центрични пръстени) в лимфоцитите на периферната кръв на облъчен организъм. Според Севанкаев и др. успешна оценка на индивидуалната доза по този метод е възможна само веднага след еднократна остра експозиция или след 3-4 месеца. Това се дължи на факта, че аберратните клетки постепенно се отстраняват (елиминират) от циркулиращата кръв с течение на времето [12].
Метафазният метод изисква клетъчна култура при in vitro условия. Това усложнява използването му в екстремни условия и в случаите, когато са необходими изследвания за селекция/сортиране (скрининг) в големи количества [10].
Методът на флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) е един от най-точните методи за откриване на облъчване на организъм [4]. Методът се основава на селективно оцветяване на двойки хромозоми с помощта на молекулярни сонди, специфични за определени ДНК последователности и позволява относително бърз анализ на значителен брой (няколкостотин) клетки за наличие на стабилни хромозомни аберации. В същото време, използвайки оцветяване на центромерите, техниката прави възможно разграничаванетосиметрични обмени от дицентрици [11; 7]. Методът FISH позволява ясно да се идентифицират стабилни хромозомни аберации под формата на транслокации, които представляват обмен на региони между изследваните и други хромозоми, тъй като неговият оцветен регион във флуоресцентен микроскоп се подчертава върху други хромозоми [11; 5].
За да се определи фактът на експозиция, се използва библиотека от гени от няколко хромозоми, последвано от преизчисляване на откритите щети за целия геном. Подобно преизчисляване обаче не винаги е адекватно, тъй като хромозомите имат различна радиочувствителност поради много причини, включително: дължина на теломерите, генен състав, наличие на общи и крехки места и др. Всички тези проблеми могат да бъдат решени с помощта на многоцветния FISH метод [4].
Методът FISH се счита за обещаващ метод на биологична дозиметрия за оценка на дозата в дългосрочен план след облъчване, дори при ниски нива на радиационно облъчване [9; 7]. При маймуни Macaca mulatta беше потвърдено, че ясната зависимост на честотата на индуцираните транслокации от дозата радиация продължава 28 години след възникването им; тези данни също така потвърждават ефективното запазване на реципрочните транслокации в кариотипа, което може да се използва като "исторически маркер" на предишни експозиции. Освен това сравнението на данните, получени in vitro и in vivo показва, че честотата на транслокациите, индуцирани през 1965 г., се запазва [31].
Методът FISH дава възможност за ефикасен анализ на стабилни хромозомни аберации при ниски дози радиация [9]. Използването на този метод за биодозиметрия при високи дози (повече от 1,5 Gy) може да бъде трудно поради факта, че в някои стволови клетки ще бъдат индуцирани както стабилни, така и нестабилни хромозомни аберации.Клетките, съдържащи и двата вида тези аберации, умират репродуктивно поради наличието на нестабилни аберации в тях. В този случай някои от стабилните аберации, съдържащи се в същите клетки, изчезват от анализа, което ще доведе до относително намаляване на тяхната честота в лимфоцитите на периферната кръв, в резултат на което ретроспективната оценка на дозата ще бъде по-малко надеждна.
Но към днешна дата вероятността за участие на различни хромозоми във формирането на стабилни аберации не е напълно проучена. Засега не може напълно да се изключи възможността за образуване на клонални аберации в облъчени организми и възможността за по-често или, обратно, по-рядко участие на определени хромозоми в образуването на стабилни хромозомни аберации. Следователно използването на метода FISH при преизчисляване на наблюдаваната честота на стабилни аберации за целия кариотип може да надцени или, обратно, да подцени честотата на тези аберации в сравнение с реалната честота. Съответно това ще доведе до надценяване или подценяване на дозата.
От всички видове хромозомни аберации, за целите на диагностицирането на радиационни увреждания, най-често се използва броенето на дицентрици, ацентрични фрагменти и центрични пръстени. Биологичната дозиметрия за хромозомни аберации в лимфоцитна култура предоставя надеждна информация в случаи на относително равномерна експозиция [5; 8]. При неравномерно облъчване със спад на дозата повече от 2-3 пъти, информационното съдържание на индикатора намалява. В същото време неравномерността на облъчването може да се оцени по естеството на разпределението на дицентриците в клетките и чрез сравняване на данните, получени с помощта на различни цитогенетични параметри [5].
Така че дори при ранен цитогенетичен анализ, който изключва елиминирането на хромозомни аберации, дължащи се на клетъчна смърт, върху кривата на дозата в диапазона на ниски дозиот 0,1 - 0,2 Gy до 0,5 Gy, разпространението на отделните стойности е толкова голямо, че установяването на дозата на облъчване се превръща в труден проблем. В същото време има данни за дългосрочно запазване на хромозомни аберации в лимфоцитите на периферната кръв при специалисти, работещи с източници на йонизиращо лъчение. Ретроспективна оценка на индивидуалните дози обаче не може да бъде извършена [6].
Ако сравним дозовите криви на зависимостта на броя на хромозомните аберации и микроядрата при едно и също облъчване, тогава тяхното сходство става очевидно. Но корелационният анализ на тези показатели при едни и същи индивиди показва коефициент на корелация не повече от 0,55, което от своя страна показва различен характер на появата на микроядра и хромозомни аберации [3].
По този начин значителната междуиндивидуална вариабилност както в спонтанната честота, така и в радиочувствителността на индивидите прави горепосоченото предимство на микронуклеарния тест съмнително за целите на биодозиметрията, т.е. микронуклеарният тест съдържа всички същите недостатъци, присъщи на традиционния цитогенетичен метод [11].
От своя страна микронуклеарният тест не изисква много обучение на персонала и определянето може да бъде автоматизирано. Обещаващо е да се оцени добивът на микроядра в облъчени популации от клетки и техните потомци. Използването на микронуклеарния тест при изследване на ефектите на мутагенни и канцерогенни лекарства върху тялото се дължи на простотата и стабилността на резултатите, получени с този метод, в сравнение с метода на хромозомния анализ.