Метод за инактивиране на човешки имунодефицитен вирус и други вируси в човешка кръвна плазма с
Изобретението се отнася до медицината. Студената денатурация на вирусни патогени се извършва в препарати от човешка кръвна плазма, която е под повишено хидростатично налягане от 2500 atm, след което се охлажда до температура (-15)-(-20)°C. Изобретението може да се използва за инактивиране на вирусни патогени в препарати от кръвна плазма, като същевременно се поддържа функционалната активност на протеиновата част на препаратите от кръвна плазма. 1 табл.
Чертежи към патент България 2152994
Изобретението се отнася до медицината и може да се използва за инактивиране на вирусни патогени в препарати от кръвна плазма при запазване на функционалната активност на протеиновата част на препаратите от плазма.
Известен метод за инактивиране на вирусни патогени чрез постепенна, многоетапна топлинна обработка на кръвни продукти (фибриноген и фактори VIII, IX) [2].
Известен е метод за инактивиране на вируса Ебола [3] и СПИН [4] чрез излагане на светлина, съответстваща на дължини на вълните, равни на дължините на вълните на излъчване съответно на магнезий и цинк. Има инактивиране на ензимната система на вируса, което намалява репликацията на вируса.
Известен метод за инактивиране на вируси чрез облъчване [5].
Известен метод за инактивиране на вируси с помощта на фенол. Към протеиновия разтвор се добавя фенол в концентрация по-малка от 1 g/100 ml от разтвора и се инкубира за приблизително 24 часа [6].
Термичните методи на инактивиране обаче не осигуряват пълно инактивиране на такива вирусни патогени като вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV), хепатит В. Гама облъчването има инактивиращ ефект върху функционално активните и основни протеинови компоненти на плазмената фракция и когато се използваОблъчването със светлина може да инактивира други протеинови компоненти на плазмата, които включват Mg и Zn йони.
Използването на химикали за инактивиране на вируси в бъдеще изисква пълното отстраняване на тези агенти, докато важни протеинови компоненти също могат да бъдат инактивирани.
Известен метод за инактивиране на вирусни и бактериални патогени в плазмата и кръвния серум чрез обработката му чрез нагряване при +80 o C за 30 минути, тъй като повечето видове вируси се инактивират при 56-60 o C за 5 до 30 минути [1, прототип].
Топлинната обработка на кръвната плазма не води до пълно инактивиране на вирусни и бактериални патогени в кръвната плазма, а също така настъпва инактивиране на важни плазмени протеини.
Целта на изобретението е инактивирането на моделни вирусни патогени в препарати от кръвна плазма, без да се нарушават функционалните свойства на нейните протеинови молекули, по-специално на фракцията на специфични имуноглобулини.
Проблемът се решава от факта, че в метода за инактивиране на ХИВ и други вируси в човешка кръвна плазма чрез излагането им на физични фактори, включително температурна обработка, съгласно изобретението, повишено хидростатично налягане до 2500 atm се използва допълнително като физични фактори едновременно с излагане на температура, а излагането на температура се извършва чрез охлаждане на кръвната плазма до (-15) - (-20) o C.
Съществен признак на изобретението е: - обработка на кръвна плазма с повишено хидростатично налягане до 2500 atm и охлаждане до (-15) - (-20) o C.
Този метод за инактивиране на ХИВ и други вируси в човешката плазма при запазване на функционалната активност на протеините на кръвната плазма не е известен от литературата, което показвасъответствие на заявеното изобретение с критерия "новост" и "изобретателско ниво".
Следващото е пример за конкретно изпълнение на изобретението.
Два модела вируси: вирус на човешка имунна недостатъчност (HIV-1) и морбили се отглеждат по обичайния метод върху разрешителни клетъчни култури (съответно човешки лимфобластоидни клетки МТ-4 и фибробласти от японски пъдпъдъци), определя се първоначалната им инфекциозност, след което вирусната суспензия се излива при стерилни условия или в 0,5 ml човешка кръвна плазма, съдържаща анти-HIV имуноглобулини, или в културална среда RP MI-16 40 и поставени в стерилни пластмасови епруветки от 0,6 ml. Пластмасовите епруветки се поставят в камера за високо налягане, която представлява цилиндър с винтови капачки и електрически входове за измерване на налягането, контрол на температурата и термоелемент за поддържането й в даден режим. Кухината на камерата за високо налягане е пълна със силиконово масло, което безконтактно предава налягането, създадено ръчно в камерата, към прототипа.
Охлаждането на пробите в камерата се постига чрез подаване на течен азот през проточната система на камерата, която охлажда пробите до предварително зададена температура (-15) - (-20) o C.
Пробите в камерата с вируса се държат 30 минути при определени условия, след което се нагряват до стайна температура чрез включване на термоелемента и постепенно в режим 50 atm/min хидростатичното налягане се намалява до атмосферно. Определената последователност от операции е необходима, за да се предотврати замръзване на пробите, тъй като в случай на спад на налягането до атмосферното ниво, без първо да се повиши температурата на пробите до стайна температура, водният разтвор може да замръзне при отрицателна температура (под 0 oВ) температура. Резултатите се записват преди и след излагане на горните условия - чрез титриране на инфекциозността на вирусите на HIV-1 и морбили върху клетки, чувствителни към цитопатичното действие на тези вируси: клетки MT-4 и Vero, съответно, с оценка на клетъчната жизнеспособност чрез оцветяване с 0,4% разтвор на трипаново синьо и последващо преброяване на живи и мъртви клетки в камерата на Горяев по обичайния метод, както и чрез тестване на специфични вирусни антигени чрез ELISA и RTGA методи, съответно за HIV-1 и вирус и морбили. Специфичните анти-HIV имуноглобулини в проби с кръвна плазма се анализират чрез ELISA (Rapid" Elavia Anti-HIV, Diagnostics Pasteur, Франция) съгласно обичайния метод чрез двукратно титруване на пробите до крайното разреждане, разреждането, което надвишава OD crit, се приема като титър на пробата. Оптичната плътност се определя на спектрофотометър Multiskan, Labsystem (Финландия) при вълна gth от 492 nm.
Таблицата показва експериментални данни за конкретно изпълнение на заявеното изобретение.
Анализът на таблицата показва предимствата на предложения метод в сравнение с известния: с известния метод (нагряване при 60 o C) тестваните вируси (HIV-1 и вирус на морбили) не са напълно инактивирани, а в същото време функционално важни протеини на кръвната плазма - специфични имуноглобулини (титър на антитела след третиране при горните условия 1: 250) са частично инактивирани, от друга страна, по време на стерилизация чрез лъчелечение (ir радиация) едновременно с инактивирането на вирусни и бактериални патогени има инактивиране на функционалната активност на суроватъчните протеини. Когато се използва това изобретение, инактивирането на моделни вирусни патогени в препарати от кръвна плазма става без смущенияфункционални свойства на съставните му протеинови молекули, по-специално фракции от специфични имуноглобулини.
ЛИТЕРАТУРА 1. Земсков М.В., Соколов М.И., Земсков В.М. Основи на общата микробиология, вирусология и имунология, М., Колос, 1972, с. 117.
2. Международна заявка N 91/01138 "Многоетапен метод за топлинна обработка на фактори на кръвосъсирването". Публикувано от RJ ISM 1-8-92.
3. Патент България N2079552 "Метод за инактивиране на вируса Ебола". Публикувано BI 14.97.
4. Патент България N2097427 „Метод за инактивиране на вируса на СПИН”. Публикувано BI 33.97.
5. Каталог JRH Bioscinces. Фетален говежди серум с гама облъчване, 1998 г.
6. Европейска заявка N0281978 "Инактивиране на вируса на СПИН в протеин-съдържащи разтвори с помощта на фенол". Публикувано от RJ ISM 44-65-89.
ИСК
Метод за инактивиране на ХИВ и други вируси в човешка кръвна плазма чрез излагането им на физични фактори, включително температурна обработка, характеризиращ се с това, че като физични фактори допълнително се използва повишено хидростатично налягане до 2500 atm едновременно с температурно излагане и температурното излагане се извършва чрез охлаждане на кръвната плазма до (-15) - (-20) o C.