Метод за получаване на имуноглобулинов препарат
Изобретението се отнася до медицината и медицинската индустрия, а именно до производството на лекарства за имунотерапия и имунопрофилактика на бактериални и вирусни заболявания. Същността на метода: кръвната плазма се фракционира с етилов алкохол при ниска температура, изолира се утайка, съдържаща имуноглобулини, разрежда се в разтвор на натриев хлорид, утайка от протромбин се изолира чрез центрофугиране, рН на получения супернатант се настройва на 5.30.05, добавя се етилов алкохол до концентрация 16-18%, докато температурата се понижава до (-5) - (-6 ) o C, центрофугата на баластния седимент B се отстранява чрез фугиране, pH на получения супернатант се настройва на 5,9-6,0, DEAE-Sephadex се добавя със скорост 6-10 ml на литър разтвор, разтворът се инкубира в продължение на 1-5 часа, DEAE-Sephadex се отстранява чрез филтруване, целевият продукт се утаява чрез алкохолно утаяване, утайката се разтваря във физиологичен физиологичен разтвор, гликокол се добавя и се извършва стерилизиращо филтруване. ДЕЙСТВИЕ: Получава се високопречистен препарат имуноглобулин G, който намалява страничните реакции при прилагането му при пациенти.
Изобретението се отнася до медицината, по-специално до имунологията, и може да се използва за имунотерапия и имунопрофилактика на бактериални и вирусни заболявания.
Известни методи за производство на имуноглобулини са описани в Cohn E. J. et al (Journal of the American Chemical Society, 1946, v.68, p. 459-475) и Oncley M. et al (Journal of the American Chemical Society, 1949, v. 71, p. 541-550). Тези работи, които са в основата на създаването на технологии за производство на имуноглобулинови препарати, се състоят във фракциониране на кръвната плазма чрез алкохолен метод при ниски температури; изолиране на фракция, съдържаща имуноглобулини; разтваряне и стерилизираща филтрация. Липса на методие, че получените препарати съдържат имуноглобулини от три класа - G, A и M, като е необходимо наличието само на имуноглобулини от клас G. Наличието на имуноглобулини от класове A и M може да причини нежелани реакции при пациенти, особено при интравенозно приложение. В допълнение, наличието на тези примеси влияе неблагоприятно върху стабилността на препаратите, причинява опалесценция на разтворите и образуването на утайка по време на съхранение.
Един от методите за отстраняване на примеси от имуноглобулини А и М е използването на йонообменна хроматография върху диетил-аминоетил (DE-AE) йонообменни сорбенти. Използването на този метод е предложено за първи път от Baumstark J. S. et al (Arch. Biochem. Biophys., 1964, v. 108, p. 514-522). Този метод обаче е предназначен за лабораторна, а не за промишлена употреба.
Описани са методи за изолиране на кръвни продукти, включително имуноглобулини, използвайки йонообменна хроматография (Curling J.M. "Separation of Plasma Proteins", 1983, Pharmacia Fine Chemicals, A.B., Uppsala). Тези методи изискват фундаментални промени в технологията за получаване на лекарства, включително използването на специално оборудване.
Най-близо до заявената техническа същност и постигнатия резултат е метод за получаване на имуноглобулинов препарат, описан в сборника "Кръвни продукти. Инструктивно-методически материали за контрол и производство", под редакцията на Burenkov S.P., Ed. М., 1976, с. 203-218.
Методът се състои във фракциониране на плазмата чрез алкохолен метод при ниска температура; изолиране на утайка, съдържаща имуноглобулини (фракция II+III); разреждане на фракции II+III в равен обем от 2% разтвор на натриев хлорид и 1,5 обема дестилирана вода, коригиране на рН на разтвора до 5,0-5,1;поддържане на сместа при температура 0-1 o C; изолиране на протромбинов баластен седимент чрез центрофугиране; добавяне към центрофугата-1 на етилов алкохол до крайна концентрация от 13%, като същевременно се понижава температурата на разтвора (-3)-(-5) o C; изолиране на баластен седимент В чрез центрофугиране, филтриране на получения центрофугат-2, регулиране на рН на разтвора до 6,9-7,0, добавяне на етилов алкохол до крайна концентрация 25% при температура (-8)-(-10) o C; изолиране на утайката от целевия продукт чрез центрофугиране; разреждане на утайката от имуноглобулини в 0,9% разтвор на натриев хлорид, добавяне на гликокол до крайна концентрация от 2%, стерилизираща филтрация. Недостатъкът на този метод е наличието на примеси от имуноглобулини А и М в целевия продукт.
Проблемът, решен с изобретението, е подобряването на технологията за получаване на имуноглобулин.
Техническият резултат от използването на изобретението е подобряване на качеството на лекарството чрез отстраняване на примесите на имуноглобулини А и М.
Този резултат се постига чрез факта, че в метода за получаване на имуноглобулинов препарат чрез фракциониране на кръвна плазма с етилов алкохол при ниска температура, изолиране на утайка, съдържаща имуноглобулини, разреждане в разтвор на натриев хлорид, изолиране на протромбинова утайка чрез центрофугиране, добавяне на етилов алкохол към центрофуга-1, изолиране на баластна утайка В чрез центрофугиране, изолиране на утайка от целевият продукт чрез утаяване с алкохол, разтваряне на утайката, добавяне на гликокол, стерилизиращо филтруване, отделяне на баластната утайка B се извършва при центрофуга-1 pH 5.30.05 чрез добавяне на етилов алкохол до концентрация 16-18%, като същевременно се понижава температурата до -(-5)-(-6) o C, след отделянето на баластната утайка B, pH на центрофугата се настройва на 5 .9-6.0, добавете DEAE-Sephadex със скорост 6-10 ml на 1 литър разтвор, инкубирайте разтвора за 1-5 часа, отстранете DEAE-Sephadex чрез филтруване.
Методът се осъществява по следния начин.
Определянето на имуноглобулини по метода на радиалната имунодифузия на Манчини позволи да се установи, че третирането на разтвори с DEAE-сефадекс позволява да се намали количеството на имуноглобулин А с 10,2 пъти и имуноглобулин М с 8,3 пъти. Промяната на параметрите на фракциониране (рН, температура, концентрация на етанол) ви позволява да намалите количеството имуноглобулин А 5,6 пъти и имуноглобулин М 3,6 пъти в сравнение с прототипа. Предимството на предложения метод е, че не изисква значителни промени в технологията за получаване на имуноглобулини и използването на специално оборудване.
Метод за получаване на препарат на имуноглобулин G чрез фракциониране на кръвна плазма с етилов алкохол при ниска температура, изолиране на утайка, съдържаща имуноглобулини, разреждането й в разтвор на натриев хлорид, изолиране на протромбинова утайка чрез центрофугиране, добавяне на етилов алкохол към супернатанта, изолиране на баластна утайка В чрез центрофугиране, изолиране на утайка от целевия продукт чрез утаяване с алкохол , разтваряне на утайката, добавяне на гликокол, стерилизираща филтрация, характеризираща се с това, че изолирането на баластния седимент В се извършва при рН на супернатантата от 5.30.05 чрез добавяне на етилов алкохол до концентрация 16-18% при понижаване на температурата до (-5) - (-6) o C, след отделяне на баластния седимент В, рН на супернатантата се настройва на 5.9-6.0, DEAE-se phadex се добавя със скорост 6-10 ml на литър разтвор, разтворът се инкубира за 1-5 часа, DEAE-ce се отстранява чрез филтриране на fadex.
PD4A - Промяна в името на притежателя на български патент за изобретение
(73) Ново имепритежател на патента:Федерално държавно унитарно предприятие „Научно-производствена асоциация за медицински имунобиологични препарати „Микроген“