Метод за получаване на ваксина срещу бруцелоза
Употреба: биотехнология, ваксина, профилактика на бруцелоза. Същността на изобретението: ваксината се получава чрез конюгиране на протеинови антигени, изолирани от ваксинния щам Br.abortus 19 с целулозна матрица в присъствието на хромов трихлорид. Изобретението дава възможност за получаване на ваксина срещу бруцелоза с биологична безопасност на производството, която създава дълготраен защитен имунитет. 4 табл.
Изобретението се отнася до ветеринарната и медицинската микробиология, по-специално до методи за производство на ваксини, използвани за профилактика на бруцелоза.
Известен метод за получаване на ваксина срещу бруцелоза, включващ култивиране на щам Brucella abortus 19 върху плътна хранителна среда, последвано от промиване на бактериалната маса, сушене чрез замразяване на микробни клетки.
Въпреки това, ваксината, получена по известен метод, има следните недостатъци: тя е жива, което води до развитие на бактерионосител; опасно за околната среда поради възможността за реверсия на напрежението; абортогенен; предизвиква образуване на антитела във високи титри, което създава трудности при диагностицирането на бруцелозата.
Известен е и метод за получаване на ваксина срещу бруцелоза, включващ култивиране на щам Brucella abottus 54, последвано от екстракция на антигена на Brucella, пречистване върху колони Sephadex G75, конюгиране с водоразтворими производни на диалдехид декстран, модифициран с грамицидин, използване на карбодиимид за конюгация и допълнително пречистване на получения конюгат. Резултатът е имуногенна ваксина, която защитава до 89% от животните, заразени с вирулентни щамове на Brucella и не предизвиква образуването на антитела.
Този метод обаче има следните недостатъци: ваксината, получена по познат метод, има недостатъчно дълго време.защитни свойства; използвания щам Brucella abortus 54 е силно вирулентен, което представлява висока биологична опасност при производството на ваксината; методът за получаване на ваксина е сложен многоетапен процес.
Целта на изобретението е да създаде дълготраен защитен имунитет, биологична безопасност на производството на ваксина и да опрости метода.
Това се постига чрез използване на целулозна матрица като носител и нейното конюгиране в присъствието на хромен трихлорид с протеини на антиген, получен от щам на ваксина срещу Brucella.
PRI me R 1. Целулозната матрица се приготвя по метода на Lehtsind E.V. и Gurvich A. E. 1981. За да направите това, памучната вата се разтваря в медно-амонячен комплекс (реактив на Швайцер) и се добавя сярна киселина, в резултат на което целулозата се утаява под формата на фина суспензия.
Разтворимият антиген на бруцела се получава по метода на Kaneene et al, 1978, за който двудневна култура от ваксиналния щам Brucella abortus 19 се измива от матраците, 50 g прясна маса на Brucella се ресуспендират в 200 ml дестилирана вода, разклаща се в продължение на 2 часа, сместа се автоклавира в продължение на 20 минути при 121 ° C и след охлаждане се центрифицира. фугиран при 12 хиляди rpm за 30 минути. Супернатантата се пречиства на Sefelex G25 колона във физиологичен разтвор. Протеиновият пик, появяващ се в обема на колоната, се събира и се смесва с целулозна матрица в съотношение 100 mg протеин на 1 g целулоза, докато се добавя 25 mM CrCl3 разтвор. Оставя се на магнитна бъркалка на студено за 1-3 дни. Измийте с физиологичен разтвор. Прикрепеният протеин се определя чрез оцветяване с бромофенолово синьо.
Получената протеиново-целулозна ваксина (PCV) е фино разделена водна суспензия с бял цвят.
Примярка 2. За изследване на предизвикания от ваксината клетъчен имунитет се определя реакция на свръхчувствителност от забавен тип (DTH). BaLb/c мишки се инжектират подкожно с различни дози от ваксината веднъж или три пъти на седмични интервали. В контролата са използвани мишки от същия внос, неваксинирани с BCV. Месец по-късно животните се инжектират в дясната лапа с допустима доза разтворим антиген (10 μg протеин в 50 μl физиологичен разтвор) и 50 μl физиологичен разтвор в лявата лапа. Нивото на ХЗТ се оценява след 24 часа чрез разликата между дебелината на експерименталните и контролните лапи. Получените резултати, представени в табл. 1 показват, че BCV, при всички използвани дози и режими, предизвиква значителен отговор на ХЗТ.
PRIME R 3. За изследване на защитните свойства на BCV в сравнение с оригиналния разтворим антиген, както и за изследване на неспецифичния ефект върху тези свойства на целулозната матрица, бели мишки без порода бяха инжектирани подкожно с различни дози BCV. В контролата мишките бяха инжектирани с оригиналния разтворим антиген на Brucella в същите дози или целулозна матрица без антиген. Месец след инжектирането, мишките бяха инжектирани интраперитонеално с 103 микробни клетки от вирулентен щам Brucella 54. Бактериологични и серологични изследвания бяха извършени 1 месец след заразяването. При бактериологични изследвания, органи на мишки се инокулират в епруветки със скосен месо-пептонен чернодробен глюкозо-глицеринов агар. Месец по-късно беше извършено окончателното преброяване на посевите и индексът на инфекцията беше изчислен по формулата AI, където а е броят на изолираните култури; L брой изследвани органи. В допълнение към индекса на инфекция (II), броят на микробните клетки на далак (брой на далака) се определя едновременно с помощта на бактериологични култури с 10-кратни разрежданияхомогенат на далака. Нивото на образуване на антитела по време на клането на животните се определя чрез реакцията на индиректна хемаглутинация.
От данните, дадени в табл. 2, следва, че BCV причинява намаляване на индекса на инфекция във всички случаи в сравнение със съответната доза от оригиналния антиген и контрола на инфекцията. Антигенните дози от 25 и 50 μg протеин са надеждни (P 4 m.c. от ваксинален щам 19. 1 и 2 месеца след въвеждането на ваксините, мишките са инфектирани интраперитонеално с Brucella от вирулентния щам 54 в доза от 10 3 m.k. Бактериологичните изследвания са извършени един месец след заразяването. Отчитането е извършено както в пример 3. ефектът на BCV 1 месец след ваксинацията е сравнима с тази за жива ваксина и 2 месеца след ваксинацията е много надеждна (P 9 mc жива ваксина щам 19. 1 месец след ваксинацията животните са заразени с 10 2 mc бруцела вирулентен щам 54. Взета е кръв в динамика след 2 седмици, 1,2, 3 месеца и е изследвана реакцията на аглутинация s (RA), фиксиране на комплемента (CSC) и индиректна хемаглутинация (IHA). Бактериологичните изследвания се провеждат както в пример 3.
Таблица данни. 4 показват, че броят на заразените животни, индексът на инфекцията и броят на далака при морски свинчета, ваксинирани с BCV, са малко по-ниски от тези, ваксинирани с жива ваксина.
В експерименталните групи животни титрите на антителата не надвишават 1:25 при RA, 1:10 при RSK и 1:20 при RNHA, докато в контролните групи титрите на антителата са средно 1:100 при RA, повече от 1:40 при RSK и 1:320 при RNHA. Тези данни показват, че имунизацията на морски свинчета с BCV в сравнение с жива ваксина от щам 19 причинява значително намалено ниво на производство на антитела и предизвиква сравним защитен ефект.
Така от примери 2-5 следва, че BCV, получен чрез прост метод за комбиниране на протеиновата част от водоразтворимия антиген на ваксина щам Brucella 19 с биологично инертен целулозен носител, предизвиква изразена реакция на клетъчен имунитет, но слабо производство на антитела и стимулира развитието на защитен имунитет, интензивността на който се увеличава с времето.
МЕТОД ЗА ПРОИЗВОДСТВО НА ВАКСИНА СРЕЩУ БРУКЕЛОЗА, включващ култивиране на бруцела, последвано от изолиране на антиген и конюгацията му с носител, характеризиращ се с това, че за култивиране се използва щамът Brucella abortus 19, антигенът се получава чрез водна екстракция, като носител се използва целулозна матрица и конюгацията на антигена с носителя се извършва при тяхното съотношение от 1 : 10 (тегловни) в присъствието на 25 тМ разтвор на хромов трихлорид.