Структура и функция на бактериородопсин
Молекулярната електроника се дефинира като кодиране (запис), обработка и разпознаване (четене) на информация на молекулярно и макромолекулно ниво. Основното предимство на молекулярното приближение се крие във възможността за молекулно проектиране и производство на устройства "отдолу нагоре", т.е. атом по атом или фрагмент по фрагмент, параметрите на устройствата се определят чрез методите на органичния синтез и генното инженерство. Две добре признати предимства на молекулярната електроника са значително намаляване на размера на устройството и забавяне на разпространението на гейта.
По принцип темповете на развитие на компютърните технологии са такива, че размерът на полупроводниковите чипове, според закона на Мур, ще се доближи до молекулярните аналози около 2030 г., което обаче ще изисква значителни финансови разходи. Изходът може да бъде хибридна молекулярна и полупроводникова технология, чийто първи търговски успех бяха течнокристалните дисплеи (LCD).
Биоелектрониката, която е клон на молекулярната електроника, изследва възможността за използване на биополимери като модули, управлявани от светлина или електрически импулси в компютърни и оптични системи (Birge R.R., 1999). Основното изискване за вероятните кандидати сред голямо семейство биополимери е, че те трябва обратимо да променят структурата си в отговор на някакво физическо въздействие и да генерират поне две дискретни състояния, които се различават по лесно измерими физически характеристики (например спектрални параметри).
В това отношение значителен интерес представляват протеините, чиято основна функция е свързана с трансформирането на светлинната енергия в химическа енергия в различнифотосинтетични системи. Най-вероятният кандидат сред тях е светлиннозависимият бактериородопсин на протонната помпа (BR) от халофилния микроорганизъм Halobacterium salinarum (по-рано Halobacterium halobium), открит през 1971 г. [Oesterhelt D., Stoeckenius W., 1971].
Бактериородопсинът, съдържащ ретината протонен транспортен генератор, е трансмембранен протеин от 248 аминокиселини с молекулно тегло 26 kDa, проникващ в мембраната под формата на седем а-спирали; N- и С-терминалите на полипептидната верига са разположени от противоположните страни на цитоплазмената мембрана: N-краят е насочен навън, а С-краят е навътре от клетката (фиг. 1, 2).
Фиг. 1. BR модел в елементите на вторичната структура. Аминокиселините, участващи в протонния транспорт, са подчертани: остатъци от аспарагинова киселина в кръгове, остатък от аргинин в квадрат. С Lys-216 (K-216) се образува база на Шиф (SB). Стрелката показва посоката на протонния транспорт.
BR хромофорът, протониран ретинален алдимин с е-амино групата на остатъка Lys-216, се намира в хидрофобната част на молекулата. След поглъщането на светлинен квант по време на фотоцикъла, ретината се изомеризира от изцяло Е до 13Z-форма. Протеиновата микросреда на хромофора може да се разглежда като субстрат-специфичен рецептор за all-E/13Z-ретинал, който катализира тази изомеризация при стайна температура. В допълнение, някои аминокиселини са отговорни за потискането на изомеризациите, различни от всички - E /13Z, например от всички - E - до 7Z -, 9Z -, 11Z-ретинал. Останалата част от полипептидната верига осигурява протонен транспортен канал или предпазва фотохромната вътрешна група от влияния на околната среда.
Взаимна топография на вторични структурни елементи, образувани от BR полипептидната верига след абсорбция на светлинен квант от хромофорна молекулапромени, в резултат на което се образува канал за трансмембранен пренос на протони от цитоплазмата към външната среда. Въпреки това, молекулярният механизъм на зависимия от светлина транспорт все още не е известен.
Фиг.2. Схематичен модел на тримерната (пространствена) структура на БР (PDB Index 1FBB). Седем а-спирали образуват хромофорна кухина и трансмембранен канал за пренос на протони.
BR се съдържа в клетъчната мембрана на H. salinarum, халофилна архебактерия, която живее и се възпроизвежда в солени блата и езера, където концентрацията на NaCl може да надвишава 4 M, което е 6 пъти по-високо, отколкото в морската вода (
0,6 М). Този уникален протеин в много отношения е подобен на визуалния протеин родопсин, въпреки че техните физиологични функции са различни. Докато визуалният родопсин действа като първичен фоторецептор, който осигурява нощно виждане за повечето гръбначни животни, физиологичната роля на BR е да позволи на халобактериите да действат като факултативни анаероби, когато парциалното налягане на кислорода в околната среда е ниско. Протеинът функционира като зависима от светлината протонна помпа, която осигурява образуването на електрохимичен градиент от протони на повърхността на клетъчната мембрана, който от своя страна служи за съхранение на енергия. Основната работа, извършена от градиента, е синтезът на АТФ чрез анаеробно (фотосинтетично) фосфорилиране и в този случай е класически пример за хемиосмотичната хипотеза на Мичъл за окислително фосфорилиране. Когато няма осветяване и парциалното налягане на кислорода е високо, бактериите се връщат към аеробно окислително фосфорилиране [Lanyi J.K., 1978].
Клетките на H. salinarum също съдържат два така наречени сензорни родопсини (SR I и SR II), коитоосигуряват положителен и отрицателен фототаксис. Различните дължини на вълните се разчитат от CP I и CP II като детекторни молекули, което предизвиква каскада от сигнали, които контролират флагеларния двигател на бактерията. С помощта на този елементарен процес на възприятие на светлината микроорганизмите самостоятелно преминават към светлина с подходящ спектрален състав. Освен това клетките имат халородопсин (GH), който е зависима от светлината помпа на Cl- йони. Основната му функция е да транспортира хлоридни йони в клетката, които постоянно се губят от бактерията, движейки се в посока отвътре -> навън под въздействието на електрическото поле, създадено от БР. Механизмът на действие на GR е неясен. Предполага се, че Cl - се свързва с положително заредения кватернерен азот на протонираната база на Шиф и изомеризацията на ретината от всички -E до 13Z формата предизвиква движението на този азот с прикрепения към него Cl йон - от входа към изхода Cl - - проводящ път.
Фиг.3. Част от лилавата мембрана (изглед отгоре).
BR е локализиран в области на клетъчните мембрани на H. salinarum под формата на лилави мембрани (PMs), които образуват двуизмерни кристали с хексагонална решетка. Тези области съдържат самия протеин, някои липиди, каротеноиди и вода (фиг. 3). Обикновено те имат овална или кръгла форма със среден диаметър около 0,5 микрона и съдържат около 25% липиди и 75% протеин [Oesterhelt D., Stoeckenius W., 1974]. PM са устойчиви на слънчева светлина, излагане на кислород, температури над 80°C (във вода) и до 140°C (сухи), pH от 0 до 12, висока йонна сила (3 M NaCl), действие на повечето протеази, чувствителни към смеси от полярни органични разтворители с вода, но устойчиви на неполярни разтворители като хексан. От голямо практическо значение е съществуващата възможност за вграждане на PM вполимерни матрици без загуба на фотохимични свойства.
Индуцираният от светлина протонен транспорт е придружен от редица циклични спектрални промени в BR, чиято съвкупност се нарича фотоцикъл (фиг. 4). Тридесет години изследвания са довели до доста подробно разбиране на фотоцикъла, но подробностите за протонния транспорт все още се изучават.
Фотохимичният цикъл на BR се състои от отделни междинни продукти, които могат да бъдат идентифицирани както чрез абсорбционни максимуми, така и чрез кинетиката на образуване и разпадане. Фигура 4 показва опростен модел на BR фотоцикъла [Hampp N., 2000].
Фиг.4. Фотоцикъл BR.
Фотохимичните и термичните етапи са показани съответно като дебели и тънки стрелки. Вертикалните символи показват изцяло E конформацията на ретината (междинни продукти B и O), наклонените символи показват 13Z конформацията. На тъмно BR се превръща в смес 1:1 от D и B, тази смес се нарича адаптиран към тъмнината BR. Когато BR е осветен, настъпва светлинна адаптация, т.е. преминаване към основно състояние B . Оттам започва фотоцикълът, който води до транспортирането на протон през мембраната. По време на прехода L -> M, с продължителност около 40 µs, базата на Шиф се депротонира и Asp85 става протониран. Оттам протонът отива към външната страна на извънклетъчната част на протонния канал. По време на прехода M -> N-алдиминът е репротониран. Остатъкът Asp96 действа като протонен донор. Asp96 се репротонира през цитоплазмения протонен хемиканал. Въпреки че всички трансформации между междинни продукти са обратими, преходът от M I към M II се смята за основната необратима стъпка във фотоцикъла. По време на този преход, азотът на базата на Шиф става недостъпен за извънклетъчната част на протонния канал, а само за цитоплазмения хемиканал [Brown L.S. etal, 1998], което е свързано с конформационни промени в протеиновата молекула.
Физикохимичните свойства на междинните съединения се характеризират с дължината на вълната на техните максимуми на абсорбция и стойността на специфичния моларен коефициент на екстинкция. Протонирането на SB и конфигурацията на ретинилиденовия остатък влияят върху величината на максимумите на абсорбция. По време на фотоцикъла на BR в протеина настъпват няколко зависими от температурата конформационни промени, така че образуването на повечето междинни продукти може да бъде потиснато чрез охлаждане.
В допълнение към основния фото цикъл, има две състояния, които могат да бъдат изкуствено предизвикани. В междинните P и Q конформация на ретината е 9Z. Това се постига след фотохимично възбуждане на целия Е-ретинал, когато Asp85 се протонира едновременно. Това може да се постигне в BR от див тип при ниско pH или дейонизация (образуване на т.нар. сини мембрани), но тези препарати не са стабилни. Алтернативен подход е да се замени Asp85 с аминокиселина, имаща различна pKa стойност, която остава незаредена при интересуващото ни рН, или напълно да се отстрани карбоксилната група чрез техники за насочена мутагенеза. Стабилността на такива мутантни сини мембрани е по-висока.
Уникалните свойства на бактериородопсин осигуряват широк спектър от технически приложения, в които той може да се използва, но в момента само оптичните са търговски осъществими, тъй като тяхното интегриране в съвременните технически системи е най-просто.
Оптичните приложения се основават на използването на BR филми - полимерни матрици с различни състави с включени в тях протеинови молекули. За първи път в света такива филми на базата на див тип БР са получени и изследвани у нас в рамките на проекта "Родопсин"; през 80-те годинибеше демонстрирана ефективността и перспективите за използване на такива материали, наречени "Биохром", като фотохромни материали и среда за холографски запис.
От голям интерес е възможността за промяна на фотохимичните свойства на BR филмите:
* подмяна на естествения хромофор с модифициран;
* химични (физико-химични) въздействия;
* точкови замествания на определени аминокиселинни остатъци чрез методи на генното инженерство.
Такива модифицирани материали могат да имат ценни специфични свойства, които ще предопределят използването им като елементна база на биокомпютър.