АНТАГОНИСТИЧНА АКТИВНОСТ НА АСОЦИАТИВНИ РИЗОБАКТЕРИИ - International Journal of Experimental
Микроорганизмите, свързани с растенията, станаха обект на активни изследвания през последните години [3]. Устойчивостта на растенията към болести, причинени от почвени фитопатогени, до голяма степен се определя от резултатите от взаимодействието между кореновата система на растението и различни микроорганизми. Активната секреция на различни вещества от кореновите клетки осигурява хранителни субстрати за микроорганизми, които образуват силни асоциации с него както вътре в кореновите тъкани, така и на повърхността на корена (ризоплан), както и в почвата, непосредствено около корените (ризосфера). В тази връзка бактериите, актиномицетите, гъбите, водораслите и нематодите са концентрирани в значителни количества в ризосферата и ризоплана, значително надвишавайки броя на тези организми в обикновената почва. Грам-отрицателните бактерии от родовете Pseudomonas, Erwinia, Xanthomonas, Flavobacterium доминират главно на повърхността на вегетативните подземни растителни органи, докато Pseudomonas, Flavobacterium, Agrobacterium и Azospirillum доминират в ризосферата и ризоплана на растенията [6, 8].
От най-голям интерес за изследване на асоциативни екосимбиози с микроорганизми е ризосферата, тясна област от почвата по повърхността на корена. Навлизането и концентрацията на растителни метаболитни продукти в ризосферата обуславя високата й енергийна обезпеченост и създава специфични екохимични условия за почвените микроорганизми. Сложни смеси от леснодостъпни органични източници на енергия и въглерод активно навлизат в ризосферата от корените, което определя неговата висока микробиологична активност и формирането на специфични ризосферни микробни общности, които се различават от микробиоценозата на почвата [1]. Разнообразието на такива общности до голяма степен се определя от количествения и качествен състав на кореновите ексудати,в зависимост от вида, възрастта и условията на отглеждане на растението, както и от влиянието на комплекс от почвено-климатични фактори. От своя страна микробиологичната активност в ризосферата води до значителна промяна в химичните и физичните свойства на тази зона и натрупване на отпадъчни продукти от микроорганизми, които са биологично активни по отношение на растението. За изследване на взаимодействията на растенията с полезни форми на бактерии в ризосферата е продуктивна концепцията, според която ризобактериите образуват единна растително-микробна система (асоциация) с растението с нови свойства, определени от положителното взаимодействие на партньорите [9].
Механизмите на положителния ефект на асоциативните ризобактерии могат да бъдат разделени на два вида: 1) директно или директно стимулиране на растежа на растенията поради синтеза на различни метаболити, полезни за растенията; 2) индиректно стимулиране на растежа на растенията поради изместването и потискането на развитието на почвени фитопатогени или микроорганизми, които инхибират растежа на растенията. Асоциативната азотфиксация при определени условия има значителен принос за снабдяването на растенията с азот [13]. Най-важните механизми на взаимодействие в растително-бактериалните асоциации включват производството на фитохормони (ауксини, цитокинини и гиберелини), витамини и други биологично активни вещества от бактериите. Синтезът на ауксини от ризосферни микроорганизми до голяма степен се определя от състава на кореновите ексудати, съдържащи техния основен метаболитен прекурсор L-триптофан. Много ризобактерии са способни да синтезират цитокинини и гиберелини. Важна роля в образуването на растително-бактериални асоциации могат да играят бактериалните гликопротеини - лектини, които участват в колонизацията на корените от бактерии и също така стимулиратактивността на растителните ензими и растежните процеси [14]. Способността на ризосферните бактерии да разтварят труднодостъпни почвени фосфати отдавна се счита за важен механизъм за положителен ефект върху храненето на растенията с фосфор. Много бактерии могат да увеличат наличността на фосфати за растенията чрез просто подкисляване на околната среда по време на тяхната жизнена дейност, по-специално, когато използват захари с образуването на органични киселини [10].
Асоциативните микроорганизми, които секретират антибиотични хетерогенни вещества с ниско молекулно тегло по време на растеж, са способни да потискат активността на други микроорганизми при ниски концентрации и по този начин да повлияят на жизнената активност на растенията. Pseudomonas са способни да произвеждат широк спектър от вторични метаболити, включително антибиотици. Най-добре проучените антибиотици, които играят важна роля в потискането на болестите по растенията, са антибиотиците от групите феназини, флороглюцини, пиолутеорин, пиролнитрин и оомицин А [3].
Друг механизъм на конкурентни отношения между асоциативните бактерии и патогенната микрофлора е способността им да се снабдяват с желязо, елемент, необходим за жизнената дейност не само на бактериите, но и на растенията. Желязото, поради своята неразтворимост, е трудно достъпно. Pseudomonas са способни да произвеждат жълто-зелени флуоресцентни водоразтворими пигменти, наречени сидерофори. Сидерофорите са транспортни агенти с ниско молекулно тегло, произведени от микроорганизми за увеличаване на наличността на железни йони. Общо свойство на сидерофорите е способността да образуват шесткоординатен октаедричен комплекс с йони на фери-желязо. Сидерофорите на флуоресцентните псевдомонади имат различна химична структура и като правило имат висок афинитет към фери желязото, образувайки с негостабилни комплекси, недостъпни за използване от фитопатогени. Фитопатогените произвеждат свои собствени сидерофори, но за разлика от псевдомонадните сидерофори, те се свързват с железните йони много по-бавно и псевдомонадите печелят в конкуренцията с фитопатогените за такъв жизненоважен елемент като желязото. По този начин, свързването на желязото от сидерофори на пневмонадите води до ограничаване на растежа на фитопатогените и подобряване на растежа на растенията. Ризосферните псевдомонади потискат или забавят растежа и развитието на фитопатогенни гъби и бактерии [2].
Ризобактериите могат да имат положителен ефект върху растението само ако успешно колонизират неговата ризосфера. Това изисква способността на ризобактериите да се прикрепят към повърхността на корените на растенията, способността на бактериалните клетки да се придвижват до корените на растенията, отделяйки широк спектър от източници на въглерод и азот за хранене на микроорганизмите, и способността да се адаптират към специфичните условия на тази екологична ниша. По-специално, бактериите трябва да са устойчиви на вредни ензими (пероксидази, протеази) или токсични съединения (фенолни съединения на растенията), а в някои случаи също да имат осмотолерантност или студоустойчивост [15]. Биотичните фактори, влияещи върху оцеляването на ризобактериите, са наличието в ризосферата на конкуренти или други организми, които имат отрицателен ефект върху ризобактериите, като протозои (амеби и реснички), хищни бактерии и бактериофаги [13].
Използването на такива лекарства може да бъде насочено към постигане на няколко цели: защита на растенията и културите от фитопатогени, стимулиране на покълването на семената и растежа на растенията, подобряване на фосфорното хранене на растенията, стимулиране на образуването на възли в бобовите растения, получаване на компости,потискане на патогените на кореновите гниения на растенията и др. Повишаването на производителността на селскостопанските култури, ефективното и ограничено използване на торове и продукти за растителна защита, както и повишаването на устойчивостта и адаптацията на растенията към неблагоприятни агроклиматични условия и антропогенни въздействия са от значение за селското стопанство, както и за решаване на екологични проблеми и опазване на околната среда [4]. Тези въпроси привличат вниманието на много учени, работещи в различни области на науката: растениевъдство, почвознание, агрономство, агрохимия, екология, микробиология и др. Особено важни за решаването на тези проблеми са микробиологичните подходи и техники, които се основават на използването на потенциала на растенията и почвените микроорганизми, както и на биологичните механизми на взаимодействие между компонентите на растително-микробните системи [5]. В някои случаи е възможно да се използват смесени препарати от съвместими бактерии, включително бактерии от различни таксономични групи със задължително включване на бактерии от рода Pseudomonas. Мащабното използване в селското стопанство на биопрепарати на базата на ризосферни бактерии от рода Pseudomonas е ограничено от липсата на стандартни технологии за тяхното производство. В момента се разработват технологии за получаване на биологични препарати за различни цели на базата на ризосферни псевдомонади [7].
Единственият в България биопрепарат на базата на P. fluorescens засега е регистриран под търговското наименование "Ризоплан". По този начин вече е възможно ефективното използване на щамове Pseudomonas PGPR, правилно подбрани за специфичните условия на дадено стопанство, като биологични продукти за растителна защита, които са допълнение, а понякога и алтернатива на химическите.финансови средства. Активните изследвания в тази насока и разработваните нови технологии значително ще повишат ефективността на тези биологични продукти [11].
Целта на изследването е да се изследва антагонистичната активност на асоциирани бактерии, изолирани от представители на семействата Cucurbitaceae и Lamiaceae.
Материали и методи на изследване
Антагонистичният ефект е открит при бактерии Pseudomonas fluorescens и Bacillus subtilis, изолирани от ризосферата и ризоплана на представители на семействата Cucurbitaceae и Lamiaceae. Като тест обект са използвани Staphylococcus aureus и Escherichia coli. Хранителни среди като JSA, Endo и MPA бяха използвани за изолиране и идентифициране на използваните култури. Видовата идентификация на изолирани микробни асоциати е извършена въз основа на изследването на техните морфологични, тинкториални и биохимични свойства.
Определянето на антимикробната активност се извършва по метода на перпендикулярни удари (Глушанова, 1999). Тестовите щамове се нанасят под формата на щрих по диаметъра, след инкубиране в продължение на 2-3 дни, тестови обекти (S.aureus и E.coli.) се засяват перпендикулярно на щамовете. Антимикробните вещества, дифундиращи в дебелината на агара, забавят растежа на чувствителните към тях микроорганизми, което се проявява в образуването на зони на липса на микробен растеж (mm).
Резултати от изследването и дискусия
Проучванията показват, че характерните черти на P. fluorescens са ултравиолетова флуоресценция, оксидазно разцепване и окисляване на глюкоза OF. P. fluorescens, за разлика от B. subtilis, имаше мобилност. B.subtilis проявява манитол- и каталаза-положителна активност, не разцепва уреята, има способността да образува спори и дава положителна реакция на Voges-Proskauer.
P. fluorescensи B. subtilis показаха изразена антагонистична активност срещу двете тестови култури (Таблица 1).
Размер на зоните на липса на растеж на Е. coli и S. aureus по време на взаимодействие с асоциативни ризобактерии (mm)