Глицин, определяне по пептиден метод - Наръчник на химика 21
Химия и химична технология
Глицин, определяне по пептидния метод
Най-разпространеният метод за определяне на концентрацията на пептиди е колориметрията на реакционните продукти с нинхидрин [2]. Това е един от най-чувствителните колориметрични методи. За откриването на аминокиселини и пептиди са разработени както конвенционални, така и напълно автоматизирани опции, а реагентът нинхидрин не причинява корозия и може да се доставя с конвенционална микропомпа. Реакцията протича чрез свободни аминогрупи, но в някои случаи хромофорът се образува с нисък добив. Данни за оцветяването на дипептиди могат да бъдат намерени в [3]. За всички дипептиди, съдържащи аргинин, треонин, серин, глутаминова киселина, глицин, фенилаланин, метионин, левцин и тирозин като N-терминална аминокиселина, интензитетът на цвета е 1,6-10; за левцин тази стойност е 1,7-10. За дипептиди с М-терминален лизин и аспарагинова киселина интензитетът на цвета е малко по-висок (съответно с 20 и 29%), докато дипептидите с N-терминален хистидин и триптофан изглеждат малко по-слаби (съответно 42 и 67% от средния интензитет). Дипептидите с М-краен пролин, валин и изолевцин оцветяват много слабо [2,7-6,4 и 8,5% от средния (1,6-10) интензитет].[c.391]
Редът на редуване на аминокиселините в малки полипептидни вериги, съдържащи 5-10 аминокиселинни остатъка, може да се определи с помощта на много трудоемки и сложни аналитични методи. По този начин например е установена структурата на циклопептида грамицидин С (виж глава XV). Структурата на различни пептиди, получени чрез частична хидролиза на инсулин и хемоглобин, е установена главно чрез маркиране на крайните групи с динитрофлуоробензен [17,89]. Резултатите от тези анализипоказват, че и инсулинът, и хемоглобинът са изградени от хетерогенни фрагменти. Например, пептид А, получен от инсулин, съдържа глицин, изолевцин, валин и тирозин. Определянето на аргинин, хистидин, лизин, фенилаланин и треонин в този пептид дава отрицателни резултати. Пептид B, изолиран от същия инсулинов препарат, съдържа фенилаланин, валин, аспарагинова киселина, глутаминова киселина, лизин, треонин и аланин [89] (виж гл. 111 и XII). Получените данни показват, че изолираните от инсулин пептиди нямат периодичното редуване на аминокиселини, за което говори Бергман [90].[c.135]
Докато cr-амино групите на аминокиселините и крайните l-амино групи на пептидите реагират много бързо с азотиста киселина, E-амино групите на лизина реагират много бавно. Под действието на азотиста киселина амонякът също бавно се разлага с образуването на азот, който при хидролиза със солна киселина се отделя от амидните групи на аспарагина и глутамина [18]. Обемът на образувания азот може да бъде измерен или при атмосферно налягане, или манометрично при понижено налягане [20]. Методът на Van Slyke дава отлични резултати с повечето аминокиселини и пептиди. Трябва обаче да се има предвид, че самата азотиста киселина се разлага под действието на силно редуциращи вещества (например цистеин) с образуването на азот [21]. При определяне на азота на глицин и неговите пептиди се получават и данни, които надвишават теоретично изчислените стойности [22, 23].[c.26]
Тази интересна реакция, която всъщност е обратната на синтеза на Strecker, беше подложена на много задълбочено изследване от Van Sleik и неговите колеги [194], които установиха, че освобождаването на CO под действието на нинхидрин е характерно само за a-аминокиселини. INпо-специално, М-ациламинокиселините (и, следователно, пептидите) изобщо не образуват CO2. По този начин е възможно да се определят аминокиселини в присъствието на пептиди и протеини (N-карбоксилен метод, виж страница 169). В допълнение, алдехидът, образуван в резултат на тази реакция, е характерен за всяка аминокиселина, тъй като се различава от последната само по това, че съдържа един въглероден атом по-малко. Специфичното определяне на такъв алдехид служи като средство за определяне на съответната аминокиселина. Например глицинът и аланинът в протеиновите хидролизати могат да бъдат определени от формалдехида и ацеталдехида, образувани в резултат на реакцията с нинхидрин.[c.126]
Определянето на броя и природата на С- и М-крайните аминокиселинни остатъци направи възможно постигането на значителен успех в изясняването на структурата на някои протеини. Инсулинът се оказа първият протеин, за който редът на подреждане на всички аминокиселини е напълно установен [102–107]. Sanger и неговите сътрудници, чрез окисляване на инсулин с перформинова киселина, получиха два основни продукта, които се оказаха пептиди, съдържащи цистеинова киселина и състоящи се съответно от 21 и 30 аминокиселинни остатъка. По-късата верига (според обозначението на Sanger - пептид А) има N-краен глицинов остатък и С-краен аспарагинов остатък. В по-дългата верига (пептид В), N-терминалната аминокиселина е фенилаланин, а С-краят на веригата е аланин. С помощта на гениални трикове, състоящи се в широкото използване на метода за получаване на динитрофенилови производни с помощта на[c.27]
Синтезът на пептиди, съдържащи фенилаланин, не представлява особени затруднения (вижте например [774, 775, 1114, 2368]). Фенилаланинът, заедно с глицин и аланин, е стандартната аминокиселина, която е тествана.нови защитни групи, методи за синтез на пептиди и степен на рацемизация. За тази цел често се използва bo-Gly-L-Phe-Gly-OEt (виж глава X, A, 1, b). Пептиди, съдържащи фенилаланин, също бяха многократно синтезирани за изследване на специфичното разцепване на амидната връзка от фенилаланил-аминоацил химотрипсин. Фенилаланинът е много често срещан в естествените биологично активни полипептиди. Интересното е, че о-изомерът също е включен в много пептидни антибиотици. Пептидите, съдържащи един фенилаланинов остатък, абсорбират в ултравиолетовата област с e=187; това понякога улеснява определянето на молекулното тегло на пептидите [2389, 2393].[c.194]
За много изследвания е възможно да се избере прекурсор, който ще бъде много специфичен за определен клас макромолекули (например левцин за протеин). В такива случаи белязаните молекули могат да бъдат идентифицирани по тяхната радиоактивност в присъствието на други небелязани вещества. Въпреки това, за да се изследват различни проблеми на метаболизма, е желателно да се използва неспецифичен прекурсор, който ще бъде включен в пуклеинови киселини, протеини и други клетъчни компоненти и ще бъде маркиран. В този случай е необходимо да се раздели и пречисти всеки клас изследвани молекули. Преглед на методите за химично фракциониране на различни биополимери е даден в редица работи [2, 3]. Първият опит за използване на филтри за подобряване на фракционирането беше направен чрез разделяне на радиоактивността на различни биополимери след включване на 1-C-глицин в тях. В този случай обаче получените фракции на нуклеинова киселина бяха замърсени с пептиди, които трябваше да бъдат отстранени [4].[c.138]
Възможностите на метода за афинитетно маркиране за изследване на структурата и функциите на клетъчните рецептори са много големи. Голямо разнообразие от реактивни (включително фотоактивни) съединенияправи възможно използването им за получаване на модифицирани лиганди с различни структури и размери. Те могат да се използват и за получаване на реактивни пептиди и протеини. В последния случай е необходимо да има производно с реактивна група, свързана със строго определен аминокиселинен остатък. Пример за такова производно е говеждият инсулин, чийто лизинов остатък във В веригата е модифициран с N-[N-(2-нитро-4-азидефенил)-глицин]. Такова инсулиново производно е намерило приложение за маркиране на хормонални рецептори върху мастни клетки (адипоцити) (BC Reed et al., 1983, 1984).[c.13]
Вижте страници, където се споменава терминътГлицин, определяне чрез пептиден метод :[c.400] [c.411] [c.403] [c.490] [c.403] [c.267] [c.403] [c.490] [c.97] Нови методи за анализ на аминокиселини, пептиди и протеини (1974) -- [ c.197, c.198, c.205, c.208, c.213, c.214, c.215, c.219, c.221, c.222, c.223, c.226, c.227]